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尽管人工授精和精液冷冻保存技术已经广泛应用于养牛业,但是用冷冻保存后的猪精液进行人工授精,其受胎率和产仔数都比较低,导致利用冷冻精液进行人工授精还不能应用于养猪生产。由于猪精液具有一次射精量大但精子密度小、猪精子头部的脂肪含量高和对冷冻解冻过程中的温度变化特别敏感等特点,导致猪精子易受到冷冻解冻损伤。研究证实,由冷冻解冻导致的损伤可以通过添加冷冻保护剂来控制。尽管甘油已经被广泛应用于各种细胞的冷冻保存,但在猪精液冷冻保存上,甘油在提高猪精子活率的同时也降低了精子的顶体完整性,所以不能大量使用。因此,寻找合适的冷冻保护剂是目前猪精液冷冻保存的主要研究内容之一。本试验通过在猪精液冷冻稀释液中添加不同的多糖和低密度脂蛋白(LDL),研究多糖和LDL对猪精液冻后参数的影响,取得如下结果:1、在猪精液冷冻稀释液中添加不同浓度的绞股蓝多糖(GP)、红景天多糖(RPP)、枸杞多糖(LBP)和LDL进行试验,结果显示:3%的GP和4%的RPP可以使猪精子的冻后活率达到37.82%和42.66%(P<0.05);高浓度的GP(4%,5%,6%)和RPP(6%,8%,10%)对精子细胞膜有较好的保护作用(P<0.05);6%,8%和10%的RPP可以保护猪精子的顶体完整率(P<0.05);精子冻后获能样变化随着RPP浓度的增加而逐渐上升(P<0.05)。在猪冷冻稀释液中添加8%和9%的LDL后,猪精子冻后活率分别达到42.25%和49.33%(P<0.05);精子质膜完整率分别达到60.26%和62.68%(P<0.05);与对照组相比,添加LDL可以明显提高猪精子的顶体完整率,但是在不同浓度的LDL处理组之间,猪精子冻后的顶体完整率没有明显差异;目前的研究还发现添加不同浓度的LDL对精子冻后获能样变化没有任何影响。2、为了更好的理解LDL对猪精子冻后特征的影响,计算机辅助分析系统被用于分析冻后猪精子的运动特征,所得结果显示:高浓度的LDL(8～10%)显著提高了猪精子冻后总运动精子比例(TMS,%),达到42.25%、49.33%和43.21%;与对照组相比,在高浓度的LDL(8～10%)中,精子直线运动速度(VSL,um/s)分别达到40.35,44.18和36.71 um/s;精子在冻后的曲线运动速率(VCL,um/s)在稀释液中含有6%的LDL时最高,达到37.14 um/s(P<0.05);但是各种浓度的LDL添加都不影响冻后精子头部的侧向振幅(ALH)。3、精细胞凋亡现象表现在DNA损伤、细胞内抗氧化物酶、线粒体及caspase等活性的改变。在0.25ml细管里,8%和9%的LDL显著降低了冻后猪精子的彗星比例(CR),8～10%的LDL显著降低了尾部DNA的含量(TD)和尾距(TM,P<0.05);不同浓度的LDL都可以提高猪精子冻后超氧化物歧化酶(SOD)活性,但是只有8～10%LDL可以提高过氧化氢酶(CAT)的活性(P<0.05),而LDL对谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性没有明显影响;各种LDL浓度对冻后猪精子的线粒体活性均有保护作用(P<0.05);在0.5ml的细管中,8～10%的LDL会提高猪精子冻后总运动精子比例(TMS,%)和精子直线运动速度(VSL,um/s),降低了猪冻后精子里彗星的比例(CR)和尾部DNA的含量(TD)(P<0.05)只有SOD的活性受到8%和9%的LDL的刺激而上升(P<0.05);添加10%LDL可以显著降低0.25和0.5ml中猪精子的caspases活性(P<0.05)。4、为了研究冷冻解冻对精子影响的分子机理,不同的RNA提取方法被用于提取冻后猪精子总RNA。结果表明,利用常温条件下和加热到45℃的Trizol试剂处理猪精子,均不能获得足够数量的RNA用于基因表达检测;如果把Trizol试剂加热到70℃,则可以获得足够数量的RNA用于基因表达检测,因此,猪精子RNA的提取与Trizol试剂的温度相关。5、利用总RNA检测冷冻解冻后的基因表达的结果表明:低密度脂蛋白受体(LDLR)存在于猪冷冻解冻后的精液中,但是LDL的添加并不能改变LDLR的表达; 9%～10%的LDL显著降低GADD45B的表达;SURVIVIN在猪冷冻解冻精液中的表达量很低,在处理组之间和处理组与对照组之间均没有差异;低浓度的LDL(6%～8%)对BCL-2基因的表达影响不明显,而9%和10%的LDL明显上调了BCL-2基因的表达;高浓度的LDL(9%～10%)明显降低了BAX的表达(P<0.05),而低浓度的LDL(6%～8%)对BAX的表达没有显著影响。通过以上试验发现,LDL对冷冻解冻后猪精子的各种参数均有不同程度的积极影响,特别是LDL可以降低由于冷冻解冻导致的凋亡损伤和改变相关凋亡基因的表达,因此,LDL可以用于猪精液冷冻保存。