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目的:研究超声靶向微泡破坏(Ultrasound-targeted microbubble destruction)技术促进间充质干细胞(Mesenchymal stem cells)归巢至纤维化肝脏的潜在机制。方法:取冻存的GFP(Green fluorescent protein)标记的小鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells)经复苏、传代后培养于25cm~2培养瓶中,分为M组(对照组)、M+U60s组(超声60s组)、M+UTMD60s组、M+UTMD90s组和M+UTMD180s组,M组不作处理,超声组以频率1MHZ,输出功率0.6W/cm~2,持续辐照60s;UTMD60s组加入5μL超声微泡后以同样的超声条件辐照60s,UTMD90s组加入5μL超声微泡后以同样的超声条件辐照90s,UTMD180s组加入5μL超声微泡后以同样的超声条件辐照180s,流式细胞术、免疫组化和蛋白免疫印迹检测各组MSCs表面CXCR4的表达;台盼蓝染色检测不同处理组的细胞在0、12、36和48小时的存活率。取已造模成功的肝硬化小鼠模型40只,随机分为组I、组II、组Ⅲ和组IV,每组10只,组I经尾静脉输入1ml正常培养的MSCs(1×10~6个/1ml);组II经尾静脉输入UTMD60s处理后的1ml MSCs;组Ⅲ经尾静脉输入UTMD60s处理后的1ml MSCs后,用声强为1W/cm~2,频率为1MHZ的超声仪在小鼠肝脏上方作用2min;组IV经尾静脉先输入微泡1ml,随后立即输入UTMD60s处理后的1ml MSCs,同时给予与组Ⅲ相同的超声作用小鼠肝脏上方作用2min。48小时后采用颈椎脱臼法处死小鼠,取出肝脏组织,HE染色观察肝脏组织结构,荧光显微镜下观察各组GFP阳性细胞数。结果:(1)FCM分析显示,MSCs中GFP的表达水平约为97.21±0.19%;MSCs抗原CD29和CD44阳性率分别为97.2%和97.8%;MSCs中未表达的其他细胞谱系的特异性抗原CD34和CD45阳性率分别为2.06%和2.74%。(2)FCM分析结果表明,M+UTMD180s组中表达CXCR4的细胞百分比(8.44±1.00%)比M+UTMD60s组(6.91±0.36%)高1.22倍,比M+U60s组(1.86±0.37%)高4.53倍,比M组(0.96±0.18%)高8.79倍;M+UTMD60s组中CXCR4阳性细胞的数量明显高于M组和M+U60s组(均有P<0.01),M+UTMD60s组、M+UTMD90s组及M+UTMD180s组之间的CXCR4阳性细胞数量无显著差异(P>0.05)。(3)免疫组织化学染色显示,CXCR4主要位于细胞膜和细胞质中;在M组和M+U60s组中,CXCR4阳性细胞的数量相对较少;M+UTMD180s组(8.33±0.79%)中表达表面CXCR4的细胞比M+UTMD60s组(7.61±0.98%)高1.09倍,比M+U60s组(1.14±0.36%)高7.30倍,比M组(0.52±0.32%)高16.02倍;分析结果表明M+UTMD60s组中CXCR4阳性细胞的数量明显高于M组和M+U60s组(P<0.01),M+UTMD60s组、M+UTMD90s组及M+UTMD180s组之间的CXCR4阳性细胞数量没有显著差异(P>0.05)。(4)蛋白免疫印迹结果显示,与M组(0.06±0.04)和M+U60s组(0.12±0.04)相比,M+UTMD60s组的CXCR4水平更高(0.92±0.09)(P<0.01);与其他所有组相比,M+UTMD180s组(1.04±0.09)的水平最高。(5)台盼蓝染色结果表明,超声处理60s和UTMD处理60s对细胞存活率无明显影响;随着UTMD处理时间从60s增加到180s,处理48小时后,细胞存活率从86.33±1.89%降至38.00±1.63%。(6)造模7周后,小鼠肝脏HE染色切片可见纤维化,肝小叶破坏,大量肝细胞凋亡和炎性细胞浸润;荧光显微镜显示,GFP标记的MSCs大部分位于汇管区及中央静脉周围;结果表明,与组II(5.7±1.26)和组Ⅲ(6.4±1.45)相比,组IV(31.9±4.58)的GFP阳性细胞数量显着增加(P<0.01),与组I(1.7±1.09)相比,组II中GFP阳性细胞的数量(5.7±1.26)显着增加(P<0.01)。结论:(1)本研究探讨了超声靶向微泡破坏(UTMD)促进MSCs归巢至纤维化肝脏的潜在机制。我们的研究结果表明,UTMD可以通过增加MSCs表面上CXCR4的表达来促进其向纤维化肝的归巢,(2)另外,合理的超声处理对MSCs的存活率无明显影响;UTMD技术在肝表面的应用可以有更好的效果。该研究丰富了肝纤维化的治疗方法,在干细胞治疗肝纤维化方面具有广阔的前景。