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研究背景甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH,MA)属于苯丙胺类神经兴奋剂(Amphetamine-Typed Stimulant,ATS),其盐酸盐为透明的结晶体,状如冰,俗称“冰毒”。METH具有多种药理及毒理学特性,最初是作为减肥药、抗疲劳剂使用,随后发现其具有精神依赖性,因此被列入联合国精神药品公约管制的精神活性药物,然而近年世界范围内对此药的滥用呈上升趋势,国内的滥用情况也十分严峻,所以对METH毒性机制的研究成为世界面临的重大课题和研究热点。动物实验和临床资料表明,METH滥用可导致显著的精神和行为改变,如刻板运动、亢奋、易激惹等。研究显示METH对心、肝、肾等组织器官均有毒性作用,但更主要的是对中枢神经系统的毒性。METH可导致大脑纹状体、海马、皮质等多部位损伤,包括神经细胞凋亡、多巴胺(DA)耗竭、多巴胺转运体(DAT)减少和酪氨酸羟化酶活性(TH)下降。目前认为,过量多巴胺的氧化作用、谷氨酸介导的兴奋性毒性作用、线粒体功能紊乱以及大脑神经元凋亡是METH导致中枢神经损伤的可能机制,然而,当前国内外的研究结果尚不足以完全阐明METH确切的神经毒性机制。目的大量研究支持氧化应激是METH神经毒性的重要机制。我们前一阶段研究结果显示METH引起大鼠纹状体NOS活性升高,NO含量提高,产生大量的活性氧(ROS)和活性氮(RNS),这些物质可引起神经元SOD含量下降,导致中枢神经系统损伤,而nNOS的抑制剂7-NI能减轻神经毒性。研究表明不对称性二甲基精氨酸(ADMA)是一氧化氮合酶(NOS)的内源性竞争性抑制剂,可抑制NO合成,而绝大部分的ADMA为二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶(DDAH)降解。我们以往的研究发现METH中毒大鼠纹状体区DDAH 1表达升高,此外各种研究表明ADMA与氧化应激密切相关。然而METH是否通过干扰DDAH/ADMA系统影响NO的合成而产生神经毒性,目前尚未见有相关报道。N—乙酰半胱氨酸(NAC)是一种强有力的抗氧化剂,其自身具有清除自由基功能,可促进谷胱甘肽(GSH)的合成,增强组织抗氧化能力。本研究假设METH诱导纹状体氧化应激,通过DDAH/ADMA系统介导神经毒性损伤作用。为达此目的,建立METH中毒大鼠模型,运用病理学技术、分子生物学、神经化学等方法探讨METH的神经毒性,并且在此基础上检测NO上游调控系统DDAH的蛋白表达、ADMA含量及NOS活性等指标的变化,此外还对NO下游作用产物过氧亚硝酸盐(ONOO~-)进行定量以及通过TUNEL方法检测大脑神经元的凋亡与氧化应激的关系,最后研究抗氧化剂NAC对甲基苯丙胺神经毒性的影响及其与DDAH/ADMA系统的关系,从一个新的角度探讨METH神经毒性机制。方法1 METH中毒模型的建立和毒性观察Wistar雄性大鼠,共40只,体重180g～220g,12 h光暗交替循环,保持自由饮水及进食。将动物随机分为4组,NS组腹腔注射生理盐水,每天2次(8:00AM,6:00 PM),每次1mL,连续注射6天;METH组前两天注射生理盐水,第3～6天,腹腔注射METH(15mg/kg体重),注射方法同NS组;NAC组注射方法同NS组,用NAC替代生理盐水,NAC的注射剂量为150mg/kg体重;NAC+METH组前两天注射NAC,第3～6天,在METH注射前30min先腹腔注射NAC(150mg/kg体重),METH的注射方法同METH组。最后一次用药72h后,处死大鼠取脑和其它器官。在实验过程中观察动物的体重、体温和行为学改变;利用HE染色观察动物脑、心、肝、肺、肾组织病理学改变;高效液相色谱方法(HPLC)检测纹状体区DA及DOPAC含量的改变;利用ROS检测试剂盒检测纹状体区ROS含量的变化。2 NAC对METH神经损伤的保护作用涉及DDAH/ADMA系统利用荧光检测方法,用ONOO~-氧化应激试剂盒检测纹状体ONOO~-的变化;利用TUNEL方法观察纹状体神经元的凋亡情况;Western Blotting检测DDAH 1的蛋白表达;HPLC检测ADMA水平的改变;酶化学方法检测NOS活性的变化。结果1.腹腔注射METH后,大鼠的体重显著降低(P=0.000),体温显著性升高(P=0.000),并且出现显著的行为学改变(P=0.000),主要表现为活动增多、刻板样运动活跃等。镜下部分大鼠肝细胞水肿,肺广泛充血、炎细胞浸润,神经元水肿,出现明显的噬神经现象。纹状体的ROS水平显著性升高(P=0.000),DA及DOPAC水平显著降低(P=0.000;P=0.003),其差异有统计学意义。而使用NAC预处理的NAC+METH组与METH组相比,行为评分及ROS水平显著性降低(P=0.000;P=0.000),而DA及DOPAC含量显著性回升(P=0.000;P=0.040)。2.与NS组相比,METH组纹状体区DDAH 1蛋白表达水平明显升高,ADMA含量显著性降低(P=0.000),NOS活性、ONOO~-水平及神经元凋亡数均显著性增加(P=0.000,P=0.000,P=0.000)。而使用NAC预处理的NAC+METH组与METH组相比,纹状体区DDAH 1蛋白表达水平呈一定程度的回落,ADMA含量显著性回升(P=0.006),NOS活性、ONOO~-水平及神经元凋亡数均显著性降低(P=0.000,P=0.003,P=0.000)。且ADMA和ONOO~-含量之间存在负相关关系,ONOO~-含量与大脑神经元凋亡数呈正相关关系。结论1.METH诱导纹状体区组织内ROS的产生和清除失衡,产生显著的神经毒性,引起大鼠神经行为学改变,致使大脑神经元损伤,导致DA和DOPAC含量下降及ROS水平的升高,而抗氧化剂NAC可减轻以上毒性改变。2.METH诱导纹状体区的NO上游调控DDAH/ADMA系统及下游产物的改变。主要表现为大鼠脑组织纹状体区DDAH 1表达水平的升高,ADMA水平的降低,NOS活性、ONOO~-水平及神经元凋亡数的增加,且ADMA和ONOO~-水平之间存在负相关关系,但是抗氧化剂NAC可一定程度逆转以上改变,发挥神经保护作用。3.由此可见氧化应激是METH神经毒性的重要机制,而DDAH/ADMA系统可能是一个崭新的神经活性调控机制,在METH神经损伤中发挥作用。