研究背景鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma,NPC)是我国南方及东南亚各国发病率高,危害大的恶性肿瘤之一,严重威胁和影响人们的生命健康和生活质量。目前,临床仍以放射治疗作为鼻咽癌治疗的首选方法,虽然近年来放疗设备、技术及方法在不断的进步,但鼻咽癌的5年生存率、治愈率仍然维持在50%左右,并未从根本上改善治疗效果,且放疗本身带来的局部及全身副反应也给病人造成了身体及心理上的极大伤害,严重影响了治疗效果。因此,探索鼻咽癌的病因并针对其研究新的有效治疗方法尤为重要。近年来,一种新的肿瘤起源学说,即肿瘤干细胞学说正逐渐被大家所认可。肿瘤干细胞(tumor stem cell,TSC)是指存在于肿瘤组织中的一小部分具有干细胞性质的细胞群体,具有自我更新能力和不定向分化潜能,是形成不同分化程度肿瘤细胞和肿瘤不断生长的根源,是肿瘤发生、扩散、复发等过程中的起始细胞。到目前为止,已从白血病、乳腺癌、脑肿瘤、肺癌、前列腺癌等肿瘤中成功分离出肿瘤干细胞。自Toru Kondo等发现多种已建系的肿瘤细胞系中存在少量的肿瘤干细胞后,肿瘤细胞系作为肿瘤研究的经典模型有了一定的进展。国内研究也发现,人脑胶质瘤细胞在含生长因子的无血清培养基中能形成细胞球,而这种细胞球富集了肿瘤干细胞,因而称之为脑肿瘤干细胞球。另外,国外有研究表明,肿瘤干细胞中具有较高的端粒酶活性,肿瘤干细胞与端粒酶系统之间的密切关系可以解释肿瘤干细胞的无限增殖潜能及其恶性转化潜能,即端粒酶高活性可能是支撑肿瘤干细胞恶性转化的“动力源泉”,这为我们深入研究提供了切入点。到目前为止,研究鼻咽癌细胞系中肿瘤干细胞的报道不多。因此,本实验选取一株人鼻咽癌SUNE细胞系,试图通过肿瘤干细胞特异的表面标记CD133,采用免疫磁珠分选的方法分离肿瘤干细胞,用特殊的含生长因子的无血清培养基培养鼻咽癌干细胞,并根据肿瘤干细胞特有的能够自我更新和不定向分化能力对其进行鉴定,同时检测其端粒酶活性,最后将我们已构建的hTERT启动子调控TK自杀基因的特异性表达载体(hTERT/TK/pGL3),转染经免疫磁珠分选并证实的鼻咽癌干细胞中,探讨以上特异表达载体对鼻咽癌干细胞的靶向杀灭作用以及对其端粒酶系统活性的改变。研究目的研究CD133在人鼻咽癌细胞株SUNE中的表达,检测CD133~+肿瘤细胞体外增殖分化情况,对其进行肿瘤干细胞的鉴定;探讨端粒酶催化亚单位启动子/胸腺嘧啶脱氧核苷激酶基因(hTERTp/TK)肿瘤特异表达系统,对鼻咽癌细胞株SUNE中鼻咽癌干细胞端粒酶活性的影响及靶向性杀伤作用。实验方法1、SUNE细胞株的培养:鼻咽癌细胞株SUNE培养在含10%新生牛血清的RPMI 1640完全培养液中,置于5%C02、37℃饱和温度的培养箱中培养,当细胞生长到铺满培养瓶底80%H寸按1:2或1:3传代培养。2、流式细胞仪检测SUNE细胞中CD133的表达:计数约10~7的SUNE细胞,经胰酶消化处理、0.01%PBS洗涤,去上清、加入藻红蛋白(phycoerythrim,PE)标记的-CD133抗体10μL、FcR阻断剂20μL、buffer80μL,充分混匀后避光4℃冷却10 min,buffer洗涤、重悬、离心、去上清,加500μL buffer重悬细胞、上机分析。3、免疫细胞化学方法观察鼻咽癌SUNE细胞中CD133的表达:计数SUNE细胞约5X10~4,接种在培养皿中的小盖玻片上,待细胞贴壁后培养2～3d。4%多聚甲醛在室温下固定15-20 min,PBS洗涤,1%的小牛血清封闭30 min,吸除封闭剂。加PE标记的CD133抗体2.5μL,避光4℃冷却30min。0.01%PBS洗涤,缓冲甘油封片,荧光显微镜观察。4、免疫磁珠技术分选SUNE中CD133~+细胞:取总量为10~7数量级的细胞,经胰酶消化,buffer洗涤、重悬、离心、去上清。300μL buffer重悬细胞,加入FC受体100μL,抗CD133免疫磁珠100μL,充分混匀后4～8℃避光结合30 min。5 mlbuffer重悬,离心300rpm/min 10min,弃上清液,0.5 ml buffer重悬细胞,安装磁珠分选架和LS柱,3 ml buffer湿柱,将0.5 ml buffer重悬的细胞上柱,12 ml缓冲液分4次洗柱。移柱出磁场,加5 ml的buffer洗柱。所得细胞用MS柱按照上述步骤再次分选,所得CD133~+细胞离心(1000 r/min,5 min),分别用无血清培养液和含血清的RPMI1604培养液培养。5、MTT法检测CD133~+肿瘤细胞体外增殖能力:将分选的CD133~+细胞、CD133~-细胞、未分选细胞种植于96孔板上,每孔加用0.2 ml无血清含生长因子的RPMI1640完全培养液,2000细胞/孔(设空白组用于调零)。置于5%CO2、37℃饱和温度的培养箱中培养,每3天换液1次,在1、3、5、7天用四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法测定细胞的增殖状态,以490 nm的吸光度A值量化活细胞数,每组所得数据取均值,以生长天数为横轴,绘制细胞生长曲线,比较3组细胞的增殖速度。6、CD133~+肿瘤细胞体外分化能力测试:将分选后单个CD133~+细胞种植在含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液中,置5%CO2、37℃饱和温度的培养箱中培养,在培养的1、3、6、9、12天用流式细胞仪动态测试CD133~+细胞的的百分比,同时用免疫细胞化学方法再次观察鼻咽癌SUNE细胞中CD133~+的表达情况。7、检测SUNE、CD133~+、CD133~-及ECV的端粒酶活性:首先,选取四种细胞进行处理,使其细胞数量级均为2X10~6,然后根据TRAP-PCR银染法端粒酶活性检测试剂盒说明进行操作,最后在凝胶上通过比较它们梯状条带的灰度来判断端粒酶活性的大小。8、脂质体瞬时转染CMV/TK/pGL3、hTERTp/TIC/pGL3及TK/pGL3重组质粒(本实验组已构建并经鉴定)至SUNE中CD133~+的鼻咽癌干细胞,观察其端粒酶活性的变化:鼻咽癌干细胞以1X10~6/孔接种于6孔板上,用脂质体将已构建的CMV/TK/pGL3、hTERTp/TK/pGL3及TK/pGL3瞬时转染至SUNE中CD133~+的鼻咽癌干细胞,转染后4-6小时加入药物GCV,观察48小时,48小时后按照TRAP-PCR银染法端粒酶活性检测试剂盒检测端粒酶的活性。9、脂质体瞬时转染CMV/TIC/pGL3、hTERTp/TK/pGL3及TK/pGL3至SUNE中CD133~+的鼻咽癌干细胞及ECV细胞,MTT法检测细胞的活性:鼻咽癌干细胞及人的脐静脉内皮细胞ECV培养至80%左右融合时,将其以每孔1×10~5/ml个细胞、每孔体积100ul接种于96孔板上;脂质体瞬时转染CMV/TK/pGL3、hTERTp/TK/pGL3及TK/pGL3至SUNE中CD133~+的鼻咽癌干细胞及ECV细胞;转染后4-6小时后加入药物GCV,48小时后加入MTT,孵育4小时,最后加DMSO上机检测。10、统计学处理:用SPSS13.0统计软件进行数据分析,实验结果以均数±标准差(x+s)表示,组间比较用重复测量的方差分析和单因素方差分析,均数之间两两比较采用LSD法,以P＜0.05表示差异有统计学意义。结果1、鼻咽癌细胞株SUNE在含血清的RPMI 1640培养基中呈贴壁生长,增生活跃,相差显微镜观察见细胞呈梭形、扁平状、有凸起,泽光度好。2、流式细胞仪检测到CD133在SUNE中仅有微量的表达,只有0.35%的细胞表面表达膜抗原CD133。3、在SUNE细胞爬片上,少部分细胞可与抗CD133-PE结合,在荧光显微镜下见长满细胞的小载玻片上有稀疏的橙红色荧光,荧光呈球状,与细胞轮廓一致,周缘荧光强,说明CD133只在少数细胞中表达,其余的大多数细胞均不表达,且CD133表达于细胞膜。4、免疫磁珠分选SUNE中的CD133~+细胞后,立即在无血清培养基中培养,细胞呈单细胞、球形、悬浮生长,随着培养时间的延长,细胞呈团块状生长,体积逐渐增大,细胞数量增多,当培养天数达5天后,细胞呈葡萄串状生长。将悬浮细胞离心,用含10%胎牛血清的RPMI1640培养,24 h后,细胞又呈贴壁生长。5、将分选的CD133~+细胞、CD133~-细胞、未分选细胞种植于无血清培养液,同时加入生长因子来刺激细胞增殖,观察比较三种细胞分别于第1、3、5、7天的体外增殖情况,CD133~+SUNE细胞与CD133~-细胞和未分选细胞相比,有较强的体外扩增能力,且在1～3 d和5～7 d更见显著。6、免疫磁珠纯化后的CD133~+细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI 1640中,免疫荧光化学方法可以明显地观察到,随着培养时间的延长,细胞的表面抗原CD133在逐渐的减少即橙红色的荧光在逐渐的消失。同时,流式细胞仪动态检测到的CD133细胞比例与上诉结果吻合,到培养的第12天,CD133~+细胞的比例已由开始的89.33±0.882%下降至0.33±0.088%。从上诉实验结果中,我们可以了解到CD133~+鼻咽癌细胞在体外的分化情况。7、聚丙烯酰胺垂直电泳凝胶经过银染后,可以看出未分选的SUNE、CD133~+、CD133~-细胞在凝胶上显示相隔6bp的梯状条带,端粒酶活性均为阳性,且CD133~-的条带较SUNE及CD133~+的浅,表明CD133~-的端粒酶活性相对较弱,而ECV未见到相隔6bp的梯状条带,端粒酶为阴性。8、SUNE中CD133~+的鼻咽癌干细胞经转染hTERTp/TK/pGL、TK/pGL3及CMV/TK/pGL3后,再次应用TRAP-PCR银染法端粒酶活性检测试剂盒测试鼻咽癌干细胞的端粒酶活性,结果为转染hTERTp/TK/pGL及CMV/TK/pGL3组,端粒酶活性降低,在凝胶上显示相隔6bp的梯状条带但较转染前条带的灰度变浅;而TK/pGL3组与转染前端粒酶活性没有明显变化。9、MTT结果鼻咽癌干细胞:hTERTp/TK/pGL3与CMV/TK/pGL3组细胞存活率明显低于实验对照组,TK/pGL3、CMV/TK/pGL3、hTERTp/TK/pGL3各组细胞存活率平均为58.4±0.004%、20.5±0.004%、27.9±0.002%。即hTERTp/TK/pGL3与CMV/TK/pGL3组杀伤SUNE中CD133~+的鼻咽癌干细胞效果明显高于TK/pGL3实验对照组,CMV/TK/pGL3阳性对照组杀伤SUNE中CD133~+的鼻咽癌干细胞效果明显高于hTERTp/TK/pGL3。人脐静脉内皮细胞ECV:CMV/TK/pGL3组细胞存活率明显低于hTERTp/TK/pGL3及TK/pGL3组,TK/pGL3、CMV/TK/pGL3、hTERTp/TK/pGL3各组细胞存活率平均为57.7±0.001%、18.1±0.002%、58.2±0.001%。即CMV/TK/pGL3组杀伤人脐静脉内皮细胞ECV效果明显高于hTERTp/TK/pGL3及TK/pGL3实验对照组。结论1、CD133是鼻咽癌干细胞的表面标记之一。2、鼻咽癌细胞株SUNE中存在鼻咽癌干细胞。3、端粒酶催化亚单位启动子(hTERTp)调控胸腺嘧啶脱氧核苷激酶基因(TK)可以降低鼻咽癌细胞株SUNE中CD133~+鼻咽癌干细胞的端粒酶活性。4、端粒酶催化亚单位启动子(hTERTp)调控胸腺嘧啶脱氧核苷激酶基因(TK)可以特异性的杀伤鼻咽癌细胞株SUNE中CD133~+的鼻咽癌干细胞,对正常的ECV细胞没有杀伤作用。