典型环境因素影响AryS活性和CE-S水解机制的初步研究

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近年来,内分泌干扰现象引起了国内外的广泛关注。活性最强的内分泌干扰物是类固醇雌激素,主要包括雌酮E1(Estrone)、17β-雌二醇E2(17-β-Estradiol)和17α-乙炔基雌二醇EE2(17-α-ethynylestradoil),它们在ng/L级的浓度水平即可导致水生生物的性腺功能异常。水体中含有过量的雌激素不仅会影响动物正常的生长发育,也可通过食物链影响人体的生殖系统,例如女性性早熟,男性偏向女性化、精子质量和数量降低等。雌激素的主要来源是生活污水和养殖废水。水体中还存在不具干扰活性的结合型雌激素CE,包括硫酸结合型雌激素CE-S和葡萄糖醛酸结型雌激素CE-G,排入水体的CE-G可在污水输送过程中几小时内全部分解为自由雌激素,而CE-S分解较慢且含量较高,达自由雌激素含量的1/2,可被水体中芳基硫酸酯酶AryS的催化水解为自由雌激素,其具有很高的环境风险。硫酸雌酮E1-3S是最具有代表性的结合雌激素,本文将围绕“芳基硫酸酯酶的活性分析”以及“E1-3S在芳基硫酸酯酶作用下的催化反应”进行初步研究,最终获得Arys在水中对E1-3S的内分泌干扰激活机制,主要包括污水厂和受纳水体中环境因素和芳基硫酸酯酶活性的调查研究,主要环境因素对芳基硫酸酯酶活性的影响,同时测定污水中自由雌激素(E1、E2、EE2)和结合雌激素(E1-3S)的分析方法研究,分析生活污水中雌激素沿处理流程的浓度变化情况,最后测定芳基硫酸酯酶催化水解硫酸雌酮反应速率k,总结k与芳基硫酸酯酶活性的相关关系。采集污水处理厂进水口、厌氧池、曝气池、出水口和尾水受纳水体中的水样和沉积物,获得水样中pH、温度、无机硫酸盐、有机质含量和光照强度这五种环境因素实测值,根据AryS活性的测定方法测定5个采样点的活性值。依据所测定的环境因素和芳基硫酸酯酶活性的实测值,进行五种环境因素对芳基硫酸酯酶活性影响的单因素相关性分析。单因素试验表明,温度、无机硫酸盐含量、有机质含量是影响AryS活性的主要因素,进行三因素三水平正交试验考察了各因素对AryS活性的综合影响,显著性顺序为:有机质含量>温度>无机硫酸盐含量,在温度20℃、有机质含量0.02g和无机硫酸盐浓度为50mg/L时AryS的活性最高。分别采集了某污水厂及其尾水受纳水体的水样,首先对水样进行预处理,包括过滤、固相萃取和蒸发重溶解等步骤,将提取液进行HPLC-MS/MS监测分析,根据精确度和加标回收率确定该方法可同时检测自由雌激素(E1、E2、EE2)和结合雌激素(E1-3S),且回收率较高。相对于其他方法,该分析方法可减小水样容积、简化预处理过程,并为水体中内分泌干扰物的迁移、变化和归趋特性研究提供支持。根据实验结果,采样点污水中4种雌激素浓度的顺序均为E1>E2>E1-3S>EE2,雌激素浓度沿污水处理流程逐渐降低。E1-3S含量占E1含量的25~50%,占ΣSE的5%~20%,若E1-3S全部分解,则ΣSE和E1的浓度将增加10%~50%。酶促反应多数遵循一级化学反应模式,据此进行试验测定硫酸雌酮在芳基硫酸酯酶催化条件下的水解反应速率常数k,硫酸雌酮分解速率与芳基硫酸酯酶活性值呈正相关关系,当AryS活性值接近污水厂出水口时,酶催化水解反应进行72h反应物E1-3S浓度仍可达143ng/L;当AryS活性接近污水厂曝气池活性值时,酶催化水解反应进行30h反应物E1-3S浓度便可降解为初始浓度的1/2。部分结合雌激素在活性污泥处理构筑物中分解为自由雌激素被去除,一部分未被分解便进入水体,将在水体中缓慢的分解为具有干扰活性的自由雌激素,其环境风险应予以重视。
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