卵巢恶性肿瘤是最致命的妇科肿瘤，其死亡率居女性生殖系统恶性肿瘤之首。在我国，卵巢恶性肿瘤发病率为3.61～4.66/每10万，其中超过70％为上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer, EOC）[1,2]。肿瘤细胞减灭术后继以铂类为主的联合化疗是目前对中晚期上皮性卵巢癌的标准治疗方案。在过去二十年中，常规化疗的发展提高了卵巢恶性肿瘤患者的中位数成活率[3]。这些发展包括紫杉烷/铂化疗，腹腔灌注化疗，剂量密集化疗，单克隆抗体化疗[4,5]，不幸的是患者总体存活率仍然很差，长期以来晚期EOC的5年生存率始终徘徊在30%左右。治疗卵巢恶性肿瘤的最大挑战之一是对铂类药物的耐药性，以及药物的不良反应，这种病人占患者中的90%。我们迫切需要探索新的治疗方法。进一步的研究需要阐明分子信号通路如何在卵巢癌的转移、复发、以及对化疗药物的耐药中起作用。　　研究表明，卵巢癌干细胞（(Ovarian cancer stem cells, CSCs）在化疗耐药、转移和复发中起作用[6]。CSCs是一群具有干细胞属性的癌细胞，他们能通过类似干细胞的自我更新和分化不断产生癌细胞。这类细胞被认为是癌细胞中的一个特殊群体，正是它们生成了新的肿瘤，从而造成了肿瘤的转移和复发。最近，有报导称化疗可能与卵巢癌细胞上皮-间质转化（EMT）相关[7]。发生EMT的癌细胞获得独特的干细胞样属性，使得他们得以传播和形成转移灶[8]。Wnt/β-Catenin信号通路被认为是CSCs和EMT的潜在治疗靶标[9]。目前的研究发现，有3种类型的Wnt信号通路：经典的Wnt/β-Catenin通路，非经典的平面细胞极性通路，以及非经典的Wnt-Ca2+通路。这些通路被分为两类：经典的和非经典的，这两类之间的差异在于是否有β-Catenin参与，经典的Wnt/β-Catenin通路涉及β-Catenin，而非经典的通路可以不依赖β-Catenin起作用。经典Wnt/β-Catenin信号通路中，如果没有Wnt配体，或是没有受体，或是受体结合被阻断，则此信号通路是关闭的。虽然Wnt/β-Catenin信号通路的突变总体上在卵巢癌中尤其是浆液型卵巢癌中并不多见，但这些信号通路的下游基因仍然在卵巢癌的发展的过程中起重要作用[10,11]。因此，抑制Wnt/β-catenin信号通路或许是一条有效的抗肿瘤途径。　　氯硝柳胺，化学名：N－(2-氯-4－硝基苯)－5－氯水杨酰胺，是一种口服的水杨酸衍生物，临床已使用多年，主要用于杀灭寄生虫，是一种非常古老的药物[12,13]。近年来，老药新用的研究，即药物再定位（drug repositioning）受到越来越多的关注。药物再定位是指对已知生物安全、已掌握药物代谢动力学效应的药物，探寻新的药理效应，并且将药物适应症扩展到其它疾病。由于既有药物的药品安全及药代动力学已经过临床验证，药物再定位逐渐成为药品开发的新的有效途径[14-18]。药物再定位的理论基础是小分子量化合物在细胞内多种蛋白中不会只有一个作用位点，经常存在多个靶，药物作用于不同的靶点可能产生不同的作用。药物再定位的研究也让氯硝柳胺这种古老的药物重新受到人们的关注。研究发现，氯硝柳胺能通过抑制Wnt信号通路而促进肿瘤细胞的凋亡，从而发挥其抗肿瘤作用。该观点在消化道、头颈、子宫内膜、卵巢等部位的肿瘤研究中均有报导[19-20]。对动物的研究表明，氯硝柳胺没有明显的诱导癌变作用或者胚胎致畸作用。大鼠的长期实验(1000-2500毫克/公斤体重，每日两次口服）55-64天，此后加入饲料喂养大鼠（10000和25000毫克/公斤饲料），总持续时间365-381天；和狗(100毫克/公斤体重，每周两次口服胶囊）366-393天，没有发现肿瘤的发病率有增高现象。同时实验证实氯硝柳胺对血液和尿液参数没有影响，不影响肝脏和肾脏功能[21,22]。最近的研究还表明其对体外培养的人体细胞没有明显的毒副作用[12]。目前国内外对氯硝柳胺在卵巢癌中的作用及机制尚不十分明确，影响了该药物在临床上作为抗肿瘤药物的早期开发和利用，需要更多更广泛的研究做理论基础。本课题分为以下三部分对氯硝柳胺在卵巢癌中的作用及机制进行初步研究。　　第一部分氯硝柳胺对上皮性卵巢癌细胞生物学行为的影响　　目的：检测氯硝柳胺对EOC细胞增殖、迁移、凋亡、细胞周期、裸鼠皮下移植瘤成瘤能力等恶性生物学行为的影响，证实氯硝柳胺对EOC细胞生长的抑制作用，并与经典的抗癌药物顺铂（cisplatin)作对比，以进一步证实氯硝柳胺对EOC的治疗作用。　　方法：　　（1）台盼蓝染色活细胞计数、WST-1法、结晶紫染色法检测氯硝柳胺对EOC细胞的细胞毒性以及抑制EOC细胞增殖生长的作用，顺铂作对照。　　（2）细胞划痕实验实验检测氯硝柳胺作用前后EOC细胞迁移能力的变化，顺铂作对照。　　（3）Hoechst染色、流式细胞周期分析细胞周期分布的变化，顺铂作对照。　　（4）将萤火虫荧光素酶基因导入HeyA8细胞，建立稳定细胞株HeyA8-pMPB-Fluc，用HeyA8-pMPB-Fluc细胞构建EOC裸鼠皮下移植瘤模型，以小动物活体成像及传统方法检测氯硝柳胺作用前后EOC细胞皮下成瘤能力的改变。　　结果：　　（1）氯硝柳胺对EOC细胞具有细胞毒性，并能抑制其增殖生长。台盼蓝染色活细胞计数实验结果显示，与DMSO空白对照组相比，氯硝柳胺处理后，SKOV3ip1和HeyA8两种EOC活细胞数均显著性减少，药物浓度越高，剩余活细胞数越少（P<0.05）。　　WST-1分析实验结果显示，与DMSO空白对照组相比，氯硝柳胺处理后，SKOV3ip1和HeyA8两种细胞株OD值显著降低，药物浓度越高， OD值越低（P<0.05）。　　结晶紫染色结果显示，与DMSO空白对照组相比，氯硝柳胺处理后两种细胞染色明显变浅，将染色的细胞经乙酸洗脱后经分光光度计测得OD值显著降低，氯硝柳胺浓度越高，差异越大（P<0.05）。氯硝柳胺与顺铂相比无明显差异，且氯硝柳胺略优于顺铂。　　（2）氯硝柳胺能抑制EOC细胞的迁移能力，与顺铂相比无明显差异。　　细胞划痕实验结果显示，氯硝柳胺处理组和顺铂处理组的划痕闭合速度较DMSO空白对照组显著性减慢（P<0.01），尤其在药物处理36小时后，DMSO空白对照组划痕几近完全闭合，而药物处理组仍有明显划痕存在。氯硝柳胺与顺铂相比无明显差异。　　（3）氯硝柳胺能诱导EOC细胞凋亡、引起细胞周期停滞，与顺铂相比无明显差异。　　Hoechst染色实验结果显示，与DMSO空白对照组相比，氯硝柳胺和顺铂处理后的SKOV3ip1和HeyA8细胞在镜下观察到的凋亡细胞显著增多，药物浓度越高，凋亡率越高（P<0.05）。氯硝柳胺与顺铂相比无明显差异。　　流式细胞周期分析实验结果显示，与对照组相比，氯硝柳胺和顺铂处理后的SKOV3ip1、HeyA8细胞的处于增殖期的细胞显著性减少（P<0.05）。氯硝柳胺与顺铂相比无明显差异。　　（4）氯硝柳胺能抑制裸鼠皮下移植瘤成瘤能力　　成功地将萤火虫荧光素酶基因导入HeyA8细胞，筛选出稳定表达荧光素的稳定细胞株HeyA8-pMPB-Fluc，用HeyA8-pMPB-Fluc构建EOC裸鼠皮下移植瘤模型。　　小动物活体成像实验结果显示，与DMSO空白对照组相比，氯硝柳胺作用后裸鼠皮下移植瘤的荧光强度显著性降低，最后完全消失（P<0.05）。　　处死裸鼠后收集皮下移植瘤结节，发现氯硝柳胺处理组的皮下未见到移植瘤结节，DMSO空白对照组则有多个瘤结节生成（P<0.05）。　　结论：　　氯硝柳胺能抑制EOC细胞增殖、迁移能力，诱导EOC细胞凋亡、促进细胞周期停滞，抑制EOC细胞在裸鼠皮下移植瘤的成瘤能力。这一系列实验证实氯硝柳胺对卵巢癌细胞生长的抑制能力，具有抗卵巢癌新药的潜力。　　第二部分氯硝柳胺对上皮性卵巢癌细胞的作用机制研究　　目的：探讨氯硝柳胺对EOC细胞增殖、转移侵袭等恶性生物学行为的可能分子机制。　　方法：　　（1）采用细胞免疫荧光染色、萤火虫荧光素酶报告基因系统及Gaussia荧光素酶报告基因系统检测并验证氯硝柳胺对Wnt/β-catenin信号通路的影响。　　（2）细胞免疫荧光染色，检测ECO细胞中IGF-1R的表达及其在氯硝柳胺处理后的变化。　　（3）采用Gaussia荧光素酶报告基因系统筛选12条肿瘤相关信号通路，检测氯硝柳胺作用前后荧光强度的变化，筛选可能的信号通路。　　结果：　　（1）氯硝柳胺在EOC中发挥作用与Wnt/β-catenin信号通路有关。细胞免疫荧光实验结果显示，不同浓度氯硝柳胺作用前后，SKOV3ip1细胞中β-catenin的荧光强度明显减弱。　　萤火虫荧光素酶报告基因系统实验结果显示，氯硝柳胺作用后， SKOV3ip1细胞中Wnt/β-catenin的荧光读数降低。　　Guassia荧光素酶报告基因系统实验结果显示，氯硝柳胺作用前后， SKOV3ip1细胞中Wnt/β-catenin的荧光读数降低。　　（2）SKOV3ip1细胞中IGF-1R呈高表达，氯硝柳胺处理后无明显变化，证明其在ECO中发挥作用与IGF-1R信号通路可能无关。　　细胞免疫荧光染色结果显示SKOV3ip1细胞中IGF-1R呈高表达，不同浓度的氯硝柳胺处理后，无明显变化。　　（3）我们采用Guassia荧光素酶报告基因从12个肿瘤相关信号通路中筛选出2个可能涉及氯硝柳胺作用于卵巢癌机制的信号通路的基因转录的变化，它们是AP1和C-Myc。　　结论：氯硝柳胺抑制EOC细胞生长与Wnt/β-catenin信号通路有关，与AP1及C-Myc信号通路也有关。SKOV3ip1细胞中IGF-1R呈高表达，但是与氯硝柳胺抑制EOC细胞生长作用可能无关。氯硝柳胺抑制ECO细胞的生长可能是通过抑制多个信号通路发挥作用的。　　第三部分氯硝柳胺与胰岛素样生长因子受体1显性负突变体（dnIGF-1R)对上皮性卵巢癌细胞的联合作用　　目的：探讨氯硝柳胺与IGF-1R显性负突变体（dnIGF-1Rα)对ECO细胞的联合作用。　　方法：　　（1）定向克隆法构建 IGF-1R显性负性突变体腺病毒质粒dnIGF-1Rα，用HEK293细胞包装后感染体外培养的人卵巢癌SKOV3ip1细胞。　　（2）采用WST-1法以及结晶紫染色检测氯硝柳胺和dnIGF-1Rα在抑制SKOV3ip1细胞增殖中的联合作用，运用CompuSyn软件进一步分析wst-1实验数据，计算联合指数（CI）及剂量降低指数（DRI）。　　（3）采用流式细胞周期分析氯硝柳胺与 dnIGF-1Rα在促使SKOV3ip1细胞周期停滞中的联合作用。　　结果：　　（1）氯硝柳胺与dnIGF-1Rα在抑制SKOV3ip1细胞增殖方面存在协同作用。　　WST-1法实验结果显示，与空白对照相组比，氯硝柳胺联合dnIGF-1Rα处理 SKOV3ip1细胞后 OD值显著降低（ P<0.05）；用CompuSyn软件进一步分析显示dnIGF-1Rα与氯硝柳胺的CI值小于1， DRI在1.3-3.6范围波动，平均值约等于2，说明两者存在协同作用， dnIGF-1Rα能显著降低氯硝柳胺的使用剂量。采用结晶紫染色实验结果显示，与对照相比，氯硝柳胺联合dnIGF-1Rα在抑制SKOV3ip1细胞增殖中的作用显著性增强（P<0.05）。　　（2）流式细胞周期分析实验结果显示，与对照相比，氯硝柳胺联合dnIGF-1Rα促使SKOV3ip1细胞周期停滞的作用显著性增强（P<0.05）。　　结论：氯硝柳胺与dnIGF-1Rα在抑制EOC细胞增殖、促进细胞周期停滞、诱导细胞凋亡中有协同作用；联合运用dnIGF-1Rα能降低卵巢癌治疗中氯硝柳胺的使用剂量。