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7-脱氢胆甾醇是合成维生素D3的重要前体,为了在酿酒酵母中合成7-脱氢胆甾醇,酿酒酵母内源的麦角固醇合成途径必须被敲除,以解除麦角固醇对碳源的竞争。乙酰辅酶A是微生物细胞内起着关键作用的辅因子,也是碳代谢与能量代谢的中心代谢物,氨基酸代谢、脂类代谢和呼吸作用等多个生化反应都需要乙酰辅酶A的参与。以酿酒酵母这一细胞工厂生产7-脱氢胆甾醇时,需要依赖酿酒酵母内源的甲羟戊酸途径合成基本骨架,而乙酰辅酶A又是甲羟戊酸途径的起始底物。因此,如何高效供给乙酰辅酶A成为以酿酒酵母作为宿主细胞生产以乙酰辅酶A为前体的次级代谢物产品的关键。氧化还原平衡状态直接影响次级代谢物的异源合成,这就需要有效的辅因子系统来维持微生物细胞内的氧化还原动态平衡。辅因子为细胞的合成代谢与分解代谢提供了氧化还原的载体和能量传递的媒介,提高了线粒体的功能,调节细胞的生长周期。细胞内氧化还原状态主要取决于自由态NADH/NAD+的比值,自由态NADH/NAD+比值的波动会引起细胞内代谢的广泛改变。在本研究中,(1)缺失erg5基因的的酿酒酵母BY4742菌株中的麦角固醇合成被抑制,通过引入人源的C-24还原酶基因dhcr24,并过表达截断的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因thmgl,构建了一株能够合成7-脱氢胆甾醇的工程酵母,7-脱氢胆甾醇的摇瓶发酵产量为2.62 mg/L。(2)通过过表达内源的乙醇脱氢酶基因adh2和乙醛脱氢酶基因ald6,引入沙门氏菌源的乙酰辅酶A合成酶基因acs和鼠源的柠檬酸裂解酶基因acl,有效提高了细胞质内乙酰辅酶A的供给,使7-脱氢胆甾醇的摇瓶发酵产量提高到484 mg/L。(3)7-脱氢胆甾醇生产菌株表现出氧化还原不平衡,正是由于其自由态NADH/NAD+的比值均高于野生型对照组。在7-脱氢胆甾醇生产菌株中表达肺炎双链球菌源的NADH氧化酶NOX和荚膜组织胞浆菌源的选择性氧化酶AOX1组成的辅因子再生体系,能有效降低自由态NADH/NAD+的比值,缓解7-脱氢胆甾醇生产菌株中氧化还原不平衡的状态,使7-脱氢胆甾醇的摇瓶发酵产量提高到8.44 mg/L,发酵罐优化后的产量达到44.49 mg/L,为目前已知的最高产量。本研究为7-脱氢胆甾醇的生物合成及产量的提高提供了思路与参考,具有一定的指导意义。