胶质瘤是神经系统最常见的恶性肿瘤,具有高发病率,高致残率和高死亡率,目前其临床治疗效果却难以令人满意。癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活是胶质瘤的发生发展过程最基本的分子事件。因而基因治疗在胶质瘤的治疗极有前途。运用抑癌基因转移到病人体内以增强人体抗瘤能力或促使瘤体消亡又是基因治疗的首选。人ndrg2基因是邓艳春教授用消减杂交法从人脑组织中克隆得到的一个新基因,已登陆到基因库(登录号AF159092)。ndrg2是多种肿瘤组织与相应正常组织的差异表达基因,在脑、骨骼肌和唾液腺中高表达;在肝、胃肠道上皮和肺上皮中中等表达;在胸腺、骨髓和睾丸中低表达。在神经胶质瘤的组织标本和细胞系中,可发现ndrg2的表达降低。同时ndrg2在胶质瘤中过表达时,可抑制细胞增殖,同时细胞出现明显的G1期阻滞ndrg2经研究证实有ndrg2S和ndrg2L两种亚型。ndrg2S全长为2024bp,编码357个氨基酸;ndrg2L全长为2066bp,编码371个氨基酸。既往我们的研究多集中于ndrg2短基因(ndrg2S)上,而研究方法多采用免疫组化、RT-PCR和基因转染。由于ndrg2的长基因和短基因的编码区只相差42bp的核苷酸即14个氨基酸的序列,核苷酸序列的高度一致性和蛋白质抗原的相似性,使得在上述结果中不能区分开是ndrg2的长基因或短基因的作用,基因转染实验也只证明了ndrg2的短基因抗肿瘤作用,从来没有人证明ndrg2长基因是否具有相同的抗肿瘤作用。腺病毒是无包膜的线性双链DNA病毒,在自然界广泛分布,对人致病性小,不诱导癌变,较为安全,不整合入细胞基因组,遗传毒性低,宿主范围广,转染效率高,易于制备,纯化。腺病毒载体多用于基因表达,转移和治疗。转基因效率高,容易制得高滴度病毒载体,全性高,进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组,仅瞬时表达。目前已有含有ndrg2S的重组病毒构建成功。为了深入研究ndrg2基因的功能,明确ndrg2L对胶质瘤细胞的作用及其机制,为探索ndrg2的抗肿瘤机制,同时为进一步探索胶质瘤发病机制和新的治疗策略,本课题组拟建立ndrg2长短两种亚型的重组腺病毒,并利用其感染人脑胶质瘤细胞系后进行细胞生物学检测,今后进一步对该基因进行深入研究。首先,采用腺病毒表达系统ViraPowerTM Adenoviral Expression System构建腺病毒载体。首先将ndrg2两种亚型(长短2种亚型分别命名为ndrg2L,ndrg2S)利用酶切、连接、转化、扩增后提取质粒等方法克隆入入门载体pENTR2B以获得入门克隆pENTR2B-ndrg2L,pENTR2B-ndrg2S,双酶切及PCR鉴定正确后,用重组酶LR Clonase? II Enzyme Mix进行入门克隆与表达载体pAd-CMV/V5-DEST间的重组反应以获得表达克隆pAd-CMV/V5-DEST-ndrg2L和pAd-CMV/V5-DEST-ndrg2S的质粒。表达克隆经PCR鉴定后用限制性内切酶PacI线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒(分别命名为Ad-ndrg2L和Ad-ndrg2S),经过反复的感染扩增后,用半数组织培养感染剂量法(Tissue culture infective dose 50,TCID50)检测病毒滴度,用Western Blot检测重组病毒载体是否能正确表达ndrg2蛋白。结果成功构建了ndrg2基因长短2种亚型的重组腺病毒载体,并包装扩增病毒,可为肿瘤基因治疗的研究提供依据。为了探知ndrg2新的变异型(ndrg2L)是否具有抗肿瘤作用,如有作用,ndrg2基因长短两种亚型抗肿瘤作用又有无差异?本实验还采用了流式细胞术,MTT法,平板克隆形成实验的方法对用ndrg2基因长短两种亚型腺病毒感染后的胶质瘤细胞进行了检测。可以看到:利用流式细胞仪检测细胞周期,感染ndrg2两亚型腺病毒的胶质瘤细胞处于G1期的细胞数,多于感染EGFP病毒和未感染病毒的胶质瘤细胞G1期细胞数。MTT实验的结果表明:感染ndrg2两亚型腺病毒的胶质瘤细胞,与感染EGFP病毒和未感染病毒的胶质瘤细胞相比,其生长能力下降;但感染ndrg2L腺病毒和感染ndrg2S腺病毒的胶质瘤细胞生长能力没有明显差异。平板克隆形成实验的结果表明:感染ndrg2两亚型腺病毒的胶质瘤细胞,与感染EGFP病毒和未感染病毒的胶质瘤细胞相比,其克隆形成能力下降;但感染ndrg2L腺病毒和感染ndrg2S腺病毒的胶质瘤细胞克隆形成能力没有明显差异。