旋毛虫病(trichinellosis)是一种在世界范围内广泛流行的人兽共患寄生虫病。宿主由于生食或者半生食含有旋毛虫幼虫的猪肉或者其它动物肉类而感染。肠粘膜是旋毛虫侵入宿主的门户,是机体抗感染的第一道防线和重要屏障,宿主肠粘膜的免疫应答决定了旋毛虫和宿主相互作用以及旋毛虫在体内的生长和繁殖。因此,宿主肠道的免疫反应对旋毛虫在宿主体内的生长发育和致病起着至关重要的作用。P2X7受体(purinergic receptor,P2X7R)是P2家族中研究最多的受体之一,在很多免疫性疾病中起着重要的作用。P2X7R表达于多种免疫细胞表面,其中单核-巨噬细胞表面表达水平最高。P2X7R被三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)激活后形成离子膜孔通道,通过改变胞内离子环境激活下游相关信号途径,活化炎症小体进而促进细胞因子IL-1β和IL-18的合成和分泌。而IL-1β是旋毛虫感染肠道固有免疫的重要组成部分,是清除病原体的最主要效应分子之一。很多胞内病原体如结核分枝杆菌、衣原体、利什曼原虫和弓形虫等都可以通过破坏P2X7R途径逃避宿主的免疫杀伤效应,表明P2X7R作为一种启动机体免疫防御作用的触发受体,在感染性疾病中发挥着重要的作用。在旋毛虫感染的肠型期(感染后第7天),成虫以肠绒毛为食、幼虫对肠壁组织的频繁入侵引起肠组织的损伤坏死,坏死细胞向胞外释放大量ATP。已有研究表明,高浓度的ATP作为一种内源性危险信号分子可活化P2X7R。但在旋毛虫感染中,P2X7R通过介导何种免疫细胞发挥的免疫效应及其机制尚有待深入研究。巨噬细胞是表达P2X7R的最主要细胞,同时也是最早参与肠道炎症反应的固有免疫细胞。在旋毛虫感染小鼠的肠粘膜固有层和腹腔中可见大量巨噬细胞的迁移和活化,证实了巨噬细胞在旋毛虫感染肠型期的炎症反应中不可或缺的地位,但p2x7r是否介导巨噬细胞功能在旋毛虫感染中发挥免疫防御作用尚不清楚。基于以上研究资料,本课题首先检测p2x7r在旋毛虫感染小鼠肠型期小肠组织、脾脏和肠系膜淋巴结(mesentericlymphnode,mln)中的表达水平,并观察阻断p2x7r后对感染小鼠体内虫荷及巨噬细胞的影响,以期明确p2x7r在旋毛虫感染肠型期中的免疫学作用;为进一步阐明p2x7r的作用机制,观察了体外旋毛虫抗原对巨噬细胞功能和信号通路的影响,为初步阐明旋毛虫感染肠型期的免疫机制提供实验依据,为旋毛虫病的防治和相关的肠道感染性、炎症性疾病的治疗提供理论依据和潜在的作用靶点。本课题的主要研究内容如下:一、p2x7r在旋毛虫感染小鼠肠型期的表达及其作用目的:观察旋毛虫感染小鼠肠型期p2x7r的表达水平及其作用。方法:选取7-8周龄16-18g的雌性balb/c小鼠,随机分为3组(n=15):正常对照组,感染组(每鼠300条旋毛虫幼虫灌胃),亮蓝g(brilliantblueg,bbg)+感染组(bbg为p2x7r拮抗剂,按每鼠50mg/kg/d剂量在感染前1天进行小鼠腹腔注射,连续注射7天)。观察小鼠的精神状态、活动程度等一般情况,并每天记录小鼠体重变化。在感染后第7天(肠型期)剖杀小鼠,眼眶采血,颈椎脱臼处死,无菌pbs冲洗腹腔收集腹腔灌洗液和腹腔巨噬细胞,无菌取脾脏、mln和小肠组织,westernblot和免疫组织化学法检测小肠组织、脾脏和mln中p2x7r的蛋白表达水平;流式细胞术检测脾脏和mln中p2x7r+、cd11b+以及cd11b+p2x7r+细胞比例;elisa检测了血清、腹腔灌洗液及细胞培养上清中il-1β和il-18的分泌情况。为了明确p2x7r在旋毛虫感染中的作用,观察阻断p2x7r后对感染小鼠体内虫荷(成虫数和每克肌肉的幼虫数)的影响,并检测和比较了上述免疫学指标的变化。结果:与正常对照组相比,旋毛虫感染组小鼠小肠组织、脾脏和mln中p2x7r蛋白表达水平均明显升高。脾细胞以及mln细胞中p2x7r表达比例高达95%以上,cd11b+单核细胞的比例升高,且p2x7r的平均荧光强度增强,mln中cd11b+p2x7r+细胞比例增高。此外,肠道固有层可见大量cd68+巨噬细胞浸润,同时伴随p2x7r的高表达。感染小鼠体内il-1β和il-18的水平增高,尤其是小肠固有层il-1β的水平显著增高。阻断p2x7r后,感染小鼠表现为活动力明显下降、腹背弓起、耸毛等症状,镜下小肠黏膜的病理损害加重,体内的成虫数和每克肌幼虫数要明显高于感染组;小肠组织中cd68+巨噬细胞的数量减少,肠道组织中、外周血和腹腔灌洗液中il-1β和il-18的水平明显降低。结论:旋毛虫感染肠型期小鼠体内p2x7r表达上调,介导巨噬细胞促进细胞因子il-1β和il-18的合成和分泌,参与感染急性期小肠组织的免疫反应,进而发挥清除病原体的作用。二、p2x7r介导巨噬细胞发挥杀虫效应的免疫学机制目的:通过体外实验揭示p2x7r介导巨噬细胞杀伤旋毛虫的免疫学作用机制。方法:收集正常组和感染组小鼠腹腔巨噬细胞,westernblot法检测细胞内p2x7r、nlrp3、pro-caspase-1、il-1β和il-18的蛋白表达水平。体外培养人单核细胞系u937或加佛波醇肉豆蔻乙酸酯(phorbolmyristateacetate,pma)使之活化为巨噬细胞(pma-u937)后,与lps或旋毛虫成虫或幼虫抗原共培养24h,加入atp反应30min,westernblot法检测u937细胞中炎症小体nlrp3活化水平。并在相同细胞培养条件下,在atp加入前阻断p2x7r(向培养基中加入10μma740003孵育2h),观察其对胞内nlrp3活化水平的影响。收集上述不同处理组的细胞培养上清,每孔加入20条雌虫成虫,在co2细胞培养箱中培养30h,观察各组培养上清中雌虫的活动度及其产新生幼虫的数量。real-timepcr检测pma-u937细胞中p2x7r、nlrp3、pro-caspase-1和pro-il-1β的mrna水平。为探讨atp-p2x7r通路介导巨噬细胞发挥杀虫效应是否与lps/tlr4信号通路相关联,提取正常小鼠和感染小鼠小肠组织总rna后,进行转录组高通量测序和信息分析,筛选差异表达基因,进行差异基因表达模式聚类分析。结果:与正常小鼠相比,旋毛虫感染小鼠腹腔巨噬细胞中P2X7R表达上调,炎症小体NLRP3活化,Pro-caspase-1和IL-18的蛋白水平增多。旋毛虫抗原或者LPS刺激的U937细胞需要在ATP刺激下方能激活炎症小体NLRP3;阻断P2X7R后可抑制ATP对炎症小体NLRP3的活化。LPS可以诱导PMA-U937细胞中NLRP3和Pro-IL-1β的mRNA水平增高。只有LPS和ATP双重刺激下的U937细胞培养上清对旋毛虫雌性成虫和新生幼虫具有明显的杀伤效应。差异基因表达模式聚类分析结果表明,在小鼠感染的肠型期,小肠组织的TLR4、NF-κB、Pro-IL-1β、IL-6、IL-10等相关基因高表达。结论:旋毛虫感染肠型期,活化的P2X7R可介导巨噬细胞内炎症小体NLRP3的活化,进而促进IL-1β和IL-18的合成和分泌,这种活化依赖ATP对P2X7R的激活;P2X7R介导的杀虫效应依赖于LPS和ATP的双重刺激作用,ATP-P2X7R途径的这种免疫效应与LPS对TLR4/NF-κB的激活有关。