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研究背景乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)属嗜肝DNA病毒科,慢性HBV感染可导致肝衰竭、肝硬化、肝癌等严重肝脏疾病。凋亡抑制蛋白(inhibitorof apoptosis proteins,IAPs)是一类高度保守的内源性抗细胞凋亡分子家族。SMAC(Second Mitochondrial derived Activator of Caspase)与 IAPs 结合后可以诱导IAPs的多聚泛素化和降解,从而促进细胞凋亡。据文献报道,宿主细胞IAPs抑制HBV的清除,然而IAPs拮抗剂(又称SMAC类似物)可以促进HBV感染清除,该发现为我们提供了治愈HBV的新策略。此外,IAPs拮抗剂还可以通过免疫调节效应发挥抗肿瘤作用,然而其对慢性HBV感染是否具有免疫调节效应还有待研究。APG-1387是一个新颖的小分子IAPs靶向抑制剂,它是亚盛医药开发有限公司具有自主知识产权的1类原创新药。研究目的1.APG-1387是否诱导慢性HBV感染小鼠模型体内HBV的清除。2.初步探讨APG-1387促进慢性HBV感染小鼠模型体内HBV清除的机制。研究方法1.建模:选取雄性C57BL/6J和C3H/HeN小鼠,利用pAAV-HBV1.2质粒通过高压尾静脉注射的方法构建慢性HBV感染小鼠模型。2.APG-1387疗效:雅培微粒子化学发光法检测血清中HBsAg、HBeAg、HBsAb和HBV DNA水平,免疫组化检测肝组织中HBcAg表达,Southern Blot检测HBVDNA复制情况。3.APG-1387诱导凋亡和免疫调节效应:采用Tunel染色、免疫荧光、流式细胞术等方法。4.统计学:采用Graphpad Prism5.0作图及相关统计学分析,p<0.05被认为具有统计学差异。研究结果1.利用高压尾静脉注射pAAV-HBV1.2质粒进入C57BL/6J小鼠体内建立慢性HBV感染小鼠模型,APG-1387可以加速该模型中HBV的清除1.1给予APG-1387静脉注射,每周给药一次,连续4次,可以在第7周完全清除外周血中HBsAg和HBV DNA,部分小鼠外周血HBsAg清除后可以产生HBsAb。1.2肝内HBcAg免疫组化染色和肝组织HBV DNA Southern Blot显示肝组织中HBcAg无表达,肝内HBV复制中间体完全清除。2.利用高压尾静脉注射pAAV-HBV1.2质粒进入C3H/HeN小鼠体内,建立慢性HBV感染小鼠模型,APG-1387可以促进该模型中HBV的清除2.1给予APG-1387静脉注射每周给药一次,连续10次,可以完全清除外周血中HBsAg、HBeAg和HBVDNA,部分小鼠外周血HBsAg清除后可以产生HBsAb。2.2肝内HBcAg表达和HBV复制中间体亦完全清除。3.APG-1387诱导凋亡情况3.1 APG-1387静脉注射后12h血清中ALT和AST升高,随后下降,72h内恢复正常;肝组织冰冻切片Tunnel染色和Cleaved-caspase3免疫荧光染色均可见阳性表达。3.2 Tunel和HBcAg共染利用共聚焦显微镜3D重构功能可见HBcAg阳性肝细胞凋亡。4.APG-1387的免疫调节作用在利用rAAV8 HBV1.3病毒建立慢性HBV感染小鼠模型中,APG-138720mg/kg注射组与对照组相比肝内CD4阳性T细胞频数和百分比明显增加(p<0.05),CD8阳性T细胞也呈现增加趋势。利用PMA体外刺激5小时后,APG-1387处理组的胞内染色显示IFN-γ和TNF-α分泌呈现增加趋势。结论1.APG-1387通过拮抗IAPs可以快速促进慢性HBV感染小鼠模型体内HBsAg和HBV DNA的清除,是一种全新的治疗策略。2.对APG-1387清除HBV的机制进行了初步的探讨,结果提示,APG-1387处理有可能通过增敏T细胞应答而促进感染肝细胞发生凋亡,从而清除病毒。3.综上所述,APG-1387在HBV感染的治疗中具有良好的应用前景。