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促肝细胞生长素（pHGF）是按LaBrecque从大鼠再生肝中提取肝细胞刺激因子（HSS）的方法，从乳猪肝中提取的一种促进肝细胞生长的活性物质，其作用与HSS近似。为了更深入了解HSS或pHGF的生物学性能及作用机理，本实验进行了以下的研究工作：（1）观察pHGF对人皮肤成纤维细胞（HSF）及大鼠肝星状细胞（HSC-T6）增殖的影响。（2）了解pHGF对HSF，HSC-T6产生细胞外基质（ECM）如透明质酸（HA），Ⅰ型胶原（COLI）等的作用，探讨pHGF在分子生化水平上的作用机制。（3）在已有报道α1（Ⅰ）胶原基因启动子活性的基础上，观察pHGF对启动子活性的影响，进一步研究pHGF在基因转录水平上的作用。 第一部分 促肝细胞生长素对人正常皮肤成纤维细胞及 大鼠肝星状细胞增殖的影响 肝实质细胞与肝间质细胞（如肝星状细胞，枯否细胞等）一直是肝纤维化复杂的病理过程中的研究热点。已有报道pHGF在大鼠肝纤维化模型中，对肝纤维化有阻断及保护作用。为了观察pHGF的细胞学作用，本实验选择人皮肤成纤维细胞（HSF）与大鼠肝星状细胞（HSC-T6）为体外细胞模型进行研究，观察了pHGF对HSF，HSC-T6细胞增殖的影响。 HSF取自一3岁幼儿因手部烧伤后疤痕形成而需植皮的腹部正常皮肤组织，按常规组织贴块法培养。HSC一。引自德国亚深RWTH大学医院中心实验室。用培养基倍比稀释pHGF并调整终浓度至62.5，125，250，500，1000协g/ml。取对数生长期培养细胞HSF，HSC一T6，调整细胞密度为lxl05个/m1，接种于%孔板24小时后，分别加入不同浓度pHGF，孵育24小时，进行MTT试验，检测55Onm0D值。结果显示: （1）pHGH在500 ug/ml，1000 pg/ml浓度组，对HSF细胞增殖有明显抑制作用，与对照组相比较差异显著（P<0.001）。而在低于250协g/ml浓度组，pHGF对HSF细胞增殖的抑制作用不明显，与对照组比较无显著差异。（P>0.05）。（2） pHGF对HsC一T6细胞增殖在各浓度组均有明显的抑制作用，与对照组比较有明显差异（P<0.01）。其抑制增殖的起始作用浓度较对HSF的增殖抑制起始作用浓度要低，在62.5协g/m1即产生明显的抑制作用，且呈剂量依赖性改变。 本实验观察到pHGF对HSF，HSC一T。细胞的增殖均有不同程度的抑制作用。本实验还摸索了pHGF对HSF，HSC一T6细胞增殖抑制的浓度梯度，为选择合适的亚适剂量浓度进一步研究pHGF在分子生化水平以及基因水平上的作用奠定了基础。第二部分促肝细胞生长素对人正常皮肤成纤维细胞和大鼠肝星状 细胞产生细胞外基质的影响 细胞外基质（EX七racellular matrix，ECM）在 DISSe间隙内的过量沉积是形成肝纤维化的主要病理基础。ECM成分复杂，主要含胶原蛋白，结构糖蛋白，多糖类物质等。在各型胶原蛋白中，Lm型胶原是纤维化肝或硬化肝的主要成分，分别约占6070，2070。透明质酸（hyaluroniC aCid，HA）是ECM中最重要的糖胺多糖，其与其它糖胺多糖（Glyosamin。glycan，GAG）协同构成蛋白聚合体。肝纤维化时，肝星状细胞合成HA水平大大升高，且内皮细胞清除队能力下降。HA在肝纤维化致病过程中的作用已得到广泛认同，是目前众多肝纤维化生化指标中较为敏感和特异的指标。本实验以工型胶原（collagen工，c0L工）和透明质酸（HA）为代表研究促肝细胞生长素 （pHGF）对HSF、HSC一T6细胞产生ECM的影响。HSF、HSC一T6细胞培养方法按第一部分所述进行。细胞密度lx105个/ml，按每孔2ml密度接种6孔板，24小时后，将新鲜配制的pHGF分别以200 pg/ml，400pg/ml的浓度加入6孔板，继续培养24小时，取细胞上清液，进行I型胶原（COL工）、透明质酸（HA）放免分析检测。结果显示:（1）pHGF在200 pg/ml及400拼g/ml浓度组，对HSF产生HA均具有明显的抑制作用，与对照组相比，差异非常显著（P<0.01）;pHGF在200乒g/ml浓度组对HSF产生COLI的抑制作用不明显（P>0.05），当浓度增加至400 pg/耐时，抑制HSF产生COLI的作用明显，与对照组比较差异显著（P<0.05）。（2）pHGF在200且g/ml浓度组对HSC一T6细胞产生HA的抑制作用不明显，与对照组比较，无明显差异 （P>0.05），当增加浓度至 400协g/m1时对HA产生的抑制作用明显增加，与对照组比较差异显著（p<0.05）。因检测试剂的种属特异性，用人工型胶原放免试剂盒在大鼠肝星状细胞（HSC一T6）上清液中未检出COL工O 本实验在pHGF对HSF，HSC一T。细胞增殖抑制的基础上，又进一步观察到pHGF对HSF，HSC一T6细胞产生HA及COLI的抑制作用。结合前两部分实验分析，pHGF的作用不仅发生在对细胞增殖抑制的细胞水平上，而且在细胞产生ECM的分子生化水平存在调控作用。至于这种调控抑制的机理目前尚不清楚，本课题将在第三部分进一步从基因转录水平探讨pHGF的作用机理以及pHGF抑制COLI基因表达的作用机制。 第三部分促肝细胞生长素对“1（I）胶原基因 启动子活性的影响 在肝肾及皮肤等器官发生慢性炎症时，以COLI为主的胶原蛋白大量合成，是器官纤维化病理机制中的重要环节。COLI由两条a:链和一条QZ链组成，其合成主要由转录机制介导。人COLI基因上游5’侧翼区约200一40Obp的序列中