结核病是一种由结核分枝杆菌引起的一种慢性消耗性传染病。全世界每年新增近千万感染者,造成百万人死亡。我国是世界上结核病发病率最高的22个国家之一,结核病患病人数仅次于印度,位居第二。近年来,由于多重耐药结核菌株、广泛耐药结核菌株以及HIV合并感染等问题的出现,使结核病的防控工作面临更严峻的挑战。结核分枝杆菌细胞壁结构复杂,含有大量的脂类成分。结核分枝杆菌基因组中有250个基因编码假定的酶类参与了脂质的合成或分解,表明这些酶类在其生命周期或其致病中发挥着重要作用。本研究以结核分枝杆菌中Lip家族为研究对象,旨在挖掘出具有脂肪酶功能的蛋白,系统地分析酶的活性特征,鉴定出活性中心位点,分析其免疫原性,探究其在致病方面发挥的作用,从而为疫苗和新药的研发提供有价值的新思路。本研究首先克隆了结核分枝杆菌H37Rv基因组中lip家族的14个基因,在大肠杆菌中进行表达,但所有表达蛋白在各种诱导条件下都形成了包涵体,且所有复性产物检测不到脂肪酶活性。考虑到包涵体的形式下蛋白已完全失去活性,而复性效果难以评价,因而换用耻垢分枝杆菌表达系统进行表达。在穿梭载体pMV261的基础上,首先构建了乙酰胺诱导型表达载体,然后将以上14个基因在耻垢分枝杆菌表达系统中诱导表达,共有10个重组蛋白以可溶形式表达。通过对这些表达蛋白脂肪酶活性的初步筛选,发现Lip L蛋白较其他9个蛋白对长碳链脂肪具有更高的水解活性。Lip L的底物特异性结果显示,它不仅可以水解短碳链脂肪底物,对长碳链的脂肪底物也有很高的水解活性。因此,LipL属于水解非水溶性脂肪的脂肪酶,且其酶活性的发挥不需要金属离子的辅助。LipL脂肪酶活性的最适温度是37°C,最适pH为8.0,这两个特点都体现了结核分枝杆菌对其生存环境—宿主细胞微环境的适应能力。在明确LipL蛋白的脂肪酶活性后,我们基于生物信息学预测其与脂肪酶活性相关的基序可能为G359-X-S-X-G363、S88-X-X-K91或G49-G-G51。利用点突变实验对此预测进行验证,发现三个基序中G50、S88和K91三个氨基酸残基位点的突变均导致LipL的脂肪酶活性降低了90%。该结果表明脂肪酶的活性与S88-X-X-K91和G49-G-G51这两个基序是相关的,其中G50、S88和K91是活性中心的关键氨基酸残基。此外,我们进一步对Lip L蛋白进行3D结构建模,以观察其活性相关基序及关键氨基酸残基的空间位置。模拟结果显示,Lip L蛋白的二级结构由多个α螺旋和β折叠二级结构组成,这个结构符合α/β水解酶家族的特征。同时,LipL蛋白的结构表面图显示,G49-G-G51基序在蛋白表面形成了一个pocket结构,pocket结构易于与底物相结合,这与G49-G-G51基序是LipL蛋白脂肪酶活性中心且G50氨基酸残基是活性中心的关键氨基酸相符。利用同源建模,分析了lipL蛋白拓扑学的结构,进一步验证了在点突变实验中获得的有关酶活性中心位点结果。众所周知,菌体表面蛋白不仅对病原菌的致病性至关重要,通常也是重要的免疫原。通过差速离心分离分枝杆菌的各个亚细胞组分,利用Western blot技术证实了Lip L蛋白定位于分枝杆菌的细胞膜和细胞壁。该蛋白的亚细胞定位暗示其可能在分枝杆菌致病过程中起到了作用,也可能为重要的免疫原。用ELISA检测LipL蛋白与结核阳性血清的反应,结果显示结核病病人的血清中存在能与Lip L蛋白发生反应的抗体。表明LipL蛋白在结核病人感染期内有表达,并且引起了强烈的体液免疫应答。将LipL的蛋白纯化产物免疫BALB/c小鼠,结果表明LipL蛋白可诱导产生强烈的体液免疫应答,并能激活CD8+介导的T细胞免疫应答。以上结果证明LipL蛋白是分枝杆菌的一种重要免疫原。同时,将超表达LipL的耻垢分枝杆菌重组菌感染小鼠,与空载体重组菌对照组相比,Ms/LipL重组菌在小鼠肺部的定殖能力更强,表明Lip L蛋白可能与结核分枝杆菌的致病性有一定关系。综上,本研究克隆表达了结核分枝杆菌lip家族的14个基因,构建了分枝杆菌系统乙酰胺诱导表达载体,利用该表达系统鉴定出一个高活性脂肪酶LipL;详细分析了LipL蛋白的脂肪酶酶活性特征,通过点突变及同源建模证实了酶的活性中心G49-G-G51结构域;确认了Lip L蛋白在分枝杆菌中定位于细胞壁细胞膜;证实Lip L具有较好的免疫原性,能激起体液免疫和细胞免疫反应,并在分枝杆菌的致病过程中发挥了一定作用。