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类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种不明病因的慢性自身免疫性临床综合征，主要表现为慢性、全身性、侵蚀性外周关节滑膜组织。成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes, FLS)是滑膜组织的主要细胞，并与RA发病过程有着密切关系。如何抑制FLS增殖或促进凋亡是研究RA的热点。文献报道，RA发病过程中伴随着ERS的参与。当细胞遭到毒性药物、感染、缺氧等刺激时，使内质网功能紊乱，产生内质网应激(endoplasmicreticulum stress, ERS)，引起内质网腔未折叠蛋白增多和细胞内钙离子超载，激活Caspase-3，导致细胞凋亡，但是ERS是否引起FLS凋亡还未见报道。有研究发现ERS的发生伴随着细胞膜离子通道的改变，RA中ERS发挥功能是否与细胞膜离子通道蛋白有关，尚未见报道。瞬时受体电位通道7(transient receptor potential melastain7, TRPM7)是一种具有阳离子通道和蛋白激酶双重结构的双功能膜蛋白，可使自身或底物磷酸化，也被称为“通道酶”。TRPM7广泛存在于机体组织中，通过调控细胞内阳离子浓度参与细胞的生长、增殖、迁移、凋亡等多种生理病理过程。但其在RA发病过程中的作用并未被阐明。本研究选择佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)模型，因AA病理特征与RA相似，所以AA模型作为动物研究对象，FLS作为细胞研究对象，观察TRPM7对ERS诱导FLS凋亡的影响，并探讨其可能的作用机制。主要研究内容概括如下：1. ERS在模型FLS中的表达为了检测ERS在大鼠FLS中的表达变化，通过弗氏完全佐剂(completefreund’s adjuvant, CFA)建立AA模型。RT-PCR和Western blot检测模型FLS中内质网标志性蛋白CHOP的表达情况。结果发现，正常组和模型组FLS中都有CHOP表达，但是模型组CHOP的mRNA和蛋白表达明显高于正常组。提示，类风湿性关节炎FLS中ERS明显异常。2. TRPM7在FLS中的表达为了检测AA滑膜和FLS中TRPM7的表达，通过RT-PCR和Western blot检测AA滑膜和FLS中TRPM7的基因与蛋白表达情况。结果发现，正常组滑膜和FLS中存在TRPM7，且模型组TRPM7的mRNA和蛋白表达明显高于正常组。提示，AA大鼠FLS中TRPM7高表达。3. ERS诱导剂毒胡萝卜素刺激FLS凋亡及其对TRPM7的影响给予ERS诱导剂毒胡萝卜素刺激AA大鼠FLS，分别通过细胞核染色检测FLS细胞核的影响；RT-PCR法检测TRPM7、CHOP的mRNA水平；Western blot法检测TRPM7、CHOP、Calpain和Caspase-3蛋白的表达水平。结果发现，给药组能显著提高TRPM7mRNA和蛋白的表达，明显降低Caspase-3蛋白的表达水平，比正常组相比细胞凋亡增加。同时毒胡萝卜素还能增加CHOP和Calpain的蛋白表达。提示，增加ERS程度可以引起TRPM7表达增加。4.抑制TRPM7对FLS凋亡和ERS的影响采用非特异性阻断剂Gd3+或2-APB阻断AA大鼠FLS中TRPM7的表达，观察对ERS相关蛋白的表达影响，通过RT-PCR、Western blot检测TRPM7、CHOP、Calpain和Caspase-3表达水平。结果发现，Gd3+或2-APB与正常组相比，能够不同程度地降低FLS中TRPM7mRNA和蛋白的表达，减少Caspase-3的表达。进一步通过Hoechs33342进行细胞核染色发现，Gd3+或2-APB能不同程度的引起细胞核体积增大或破碎，提示FLS出现凋亡。同时，Gd3+或2-APB能够增加FLS中CHOP、Calpain的的表达，进一步提示下调FLS中TRPM7的表达可增加ERS程度。利用LipofectamineTM2000将特异性的TRPM7-siRNA转染到RA FLS中，下调TRPM7在FLS中的表达。分别通过细胞核染色检测FLS细胞核的影响；RT-PCR法检测TRPM7、CHOP mRNA的表达；Western blot法检测TRPM7、CHOP、Calpain和Caspase-3蛋白的表达水平。结果发现，与对照组相比，TRPM7-siRNA转染组细胞凋亡明显增加，同时ERS标志性蛋白CHOP明显增加，说明ERS程度明显提高。提示，阻断TRPM7表达引起细胞凋亡可能与增加ERS程度有关。5.抑制TRPM7表达对毒胡萝卜素诱导RA FLS凋亡的影响为了进一步研究TRPM7与ERS关系，先给予ERS诱导剂毒胡萝卜素诱导AA大鼠FLS凋亡，同时采用Gd3+或2-APB阻断TRPM7的表达。RT-PCR、Western blot检测TRPM7、CHOP、Calpain和Caspase-3的表达；细胞核染色检测FLS细胞核的影响。结果显示，阻断TRPM7表达能很大程度促进ERS诱导FLS凋亡。提示，抑制TRPM7表达与ERS引起FLS凋亡有关。另外，使用特异性的TRPM7-siRNA下调TRPM7在FLS中的表达。结果发现能明显的促进ERS诱导的FLS凋亡。提示，阻断TRPM7的表达可能促进ERS诱导FLS凋亡。以上结果表明：下调TRPM7表达可以增加RAFLS的凋亡，其机制可能与调控ERS有关。这为RA的研究与防治提供了新的思路。