第一部分c-kit、HIWI和波形蛋白在不同月龄大鼠睾丸和附睾的表达目的:检查c-Kit、HIWI和波形蛋白在不同月龄大鼠睾丸和附睾组织中的表达差异,研究睾丸和附睾在成熟和衰老过程中表达的规律性改变,为研究男性生殖系统衰老提供理论依据。方法:运用免疫组织化学(S-P法)检查6月龄、12月龄和24月龄SD大鼠睾丸和附睾组织中c-Kit、HIWI和波形蛋白抗血清免疫反应强度,并对其进行比较分析。结果:c-Kit特异性免疫反应阳性主要表达于精原细胞,其他细胞表达水平甚弱。附睾上皮、附睾管腔内成分亦有c-Kit阳性表达。HIWI在大鼠睾丸和附睾组织中表达也很丰富,6月龄和12月龄大鼠中各级生精细胞,特别是精原细胞和初级精母细胞为免疫反应强阳性细胞;支持细胞、间质细胞、类肌细胞和血管内皮细胞亦为HIWI阳性细胞。附睾上皮有HIWI阳性表达。但是24月龄大鼠睾丸和附睾组织中随年龄增长HIWI表达下调(P>0.05)。波形蛋白在睾丸和附睾组织中表达模式为6月龄大鼠睾丸和附睾组织中低表达,24月龄大鼠睾丸和附睾组织表达明显上调(P >0.01)。结论:c-kit、HIWI在24月龄动物睾丸和附睾组织中表达下调,波形蛋白表达随增龄而明显增强。结果提示,睾丸和附睾组织的衰老与细胞和细胞信号转导异常密切相关.第二部分Gas7在不同月龄大鼠睾丸和附睾的表达实验一Gas7-GST融合蛋白的表达和多克隆抗体的制备目的:制备Gas7多克隆抗体,为深入研究Gas7在睾丸和附睾的结构与功能的关系提供特异工具。方法:PCR扩增编码大鼠Gas7羧基末端456bp的DNA片段,DNA重组入原核表达质粒pGEX-3X,转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST-Gas7融合蛋白。经谷胱甘肽-琼脂糖珠(Glutathione Sepharose 4B)介质填充的层析柱分离纯化蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体,Western Blot检测抗体的免疫效果和抗体的特异性。结果:成功构建pGEX-3X-Gas7原核表达载体,获得分子量约为43kD的融合蛋白,免疫家兔后得到抗Gas7的多克隆抗体。通过Western Blot检测显示,抗体的效价在1:100 000以上;在脑组织和睾丸组织的表达与国外报道一致,同时发现在附睾组织亦有表达。结论:重组质粒表达的Gas7- GST融合蛋白具有良好的抗原性,成本效益良好。制备的特异性和高效价的抗Gas7的多克隆抗体,能够满足针对Gas7免疫印迹和免疫组化技术检查等实验要求。实验二Gas7蛋白及其mRNA在不同月龄大鼠睾丸和附睾的表达目的:检查Gas7蛋白及其mRNA在不同月龄大鼠睾丸和附睾组织中的表达差异,研究睾丸和附睾在成熟和衰老过程中规律性变化,旨在研究男性生殖系统衰老的病理机制。方法:运用免疫组织化学方法(S-P法)和组织原位杂交技术检查6月龄、12月龄和24月龄SD大鼠睾丸和附睾组织中Gas7蛋白及其mRNA表达情况,并对其进行比较分析。结果:免疫组化S-P法显示,Gas7蛋白在6月龄和12月龄睾丸和附睾组织中呈低表达,主要表达于减数分裂后的圆形精子细胞、长形精子细胞的尾部、间质细胞、类肌细胞、附睾管壁及精子尾部;在24月龄睾丸和附睾组织表达明显上调。原位杂交方法显示结果与免疫组化结果相似,Gas7mRNA阳性棕黄色颗粒杂交信号在6月龄和12月龄睾丸和附睾组织中呈低表达,而在24月龄睾丸和附睾组织呈高表达。结论:Gas7蛋白及其mRNA随年龄增长在大鼠睾丸和附睾表达明显增强。该结果提示,睾丸和附睾组织的衰老与细胞和细胞信号转导异常密切相关,即老化分子的堆积而影响细胞行为。