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背景:在欧洲和美洲,前列腺癌(Prostate cancer,PCa)都是比较多见的男性恶性肿瘤之一。过去十年间,国内前列腺癌的患病率和死亡率持续增长。尽管近年来前列腺癌的诊断治疗有了很大的进步,但晚期前列腺癌患者的远期预后仍然不甚理想。探寻敏感性更高的肿瘤分子标记物,研究其参与前列腺癌发生、进展的分子机制,寻找分子水平诊治前列腺癌的靶点是当前前列腺癌研究的热点。近年来,多项研究表明microRNA广泛参与前列腺癌的发生、进展和转移,是目前前列腺癌分子机制研究热点之一。MicroRNA在细胞增殖、凋亡等过程中起到非常关键的作用,而这些过程出现异常往往是导致肿瘤发生、进展的重要原因。在肺癌、乳腺癌等的研究中表明,microRNA甚至可作为诊断疾病生物学靶标,对疾病的诊断、治疗具有重要的潜在应用价值。尽管microRNA有望成为肿瘤早期诊断、病理分级及评价预后的重要指标,但至今仍然有很多microRNA的作用尚未被发现,大部分microRNA的具体生物学功能还不十分清楚。异常表达的microRNA可能参与肿瘤发生、发展的各个环节,亦可以用于疾病的监测、诊断和治疗,因此microRNA具有重要的应用前景。研究证实前列腺癌中有很多的microRNA表达发生异常,有学者发现,在前列腺癌中microRNA-125b和let-7的表达下调,其表达谱和前列腺癌的分级有相关性,另有学者发现,microRNA-17-3p能够对前列腺癌的发展有抑制作用,在恶性程度较高的前列腺癌中其表达显著减少。另外有研究表明转移性的前列腺癌中microRNA-221表达下调,似乎与前列腺癌的侵袭能力有相关性,其在未来可能作为前列腺癌侵袭能力的标记物而应用。这些都提示microRNA与前列腺癌的发病机制有密切的联系。microRNA-212位于人类的17p13.3染色体,microRNA-212在多种肿瘤发生发展中发挥重要作用。在胃癌、头颈部恶性肿瘤、非小细胞肺癌、鼻咽癌以及肝癌中,均存在microRNA-212明显表达异常。多项研究发现,microRNA-212可能参与了肿瘤的调控。在我们的预实验中发现,microRNA-212在前列腺癌组织中的表达与正常组织相比显著降低,但其在前列腺癌发生发展中的作用机制尚不清楚。目的:1.检测microRNA-212在前列腺癌组织和细胞株中的表达情况;研究microRNA-212与前列腺癌细胞增殖、侵袭及凋亡的关系;2.根据生物信息分析,对microRNA-212潜在靶点进行预测并验证,探讨microRNA-212对前列腺癌的调控机制。方法:1、收集前列腺癌组织以及癌旁组织标本,采用qRT-PCR的方法,检测microRNA-212在前列腺癌组织中的表达,并分析其与临床病理特征之间的关系。2、体外培养DU145、PC3、22RV1和LNCaP四种人类前列腺癌细胞系及正常前列腺上皮细胞系(RWWPE-1),采用qRT-PCR的方法检测四种前列腺癌细胞系及正常前列腺上皮细胞系中microRNA-212的表达情况。3、为了进一步研究microRNA-212在前列腺癌中的生物学作用,在DU145和PC3 两种细胞中,分别转染 microRNA-212 mimics、microRNA-212 inhibitor 或者NC阴性对照物。转染48小时后采用qRT-PCR检测转染效率,并通过MTT检测细胞增殖活性、Transwell实验检测细胞侵袭转移能力、流式细胞仪实验检测细胞凋亡情况。4、采用TargetScan以及microRNAanda进行生物信息学分析microRNA-212潜在的靶基因并进行验证,设计实验证实MAPK1是否为microRNA-212的靶基因并参与细胞功能的调控。5、通过动物实验,构建异体移植瘤模型,检测体内上调microRNA-212对前列腺癌细胞增殖的作用。结果:1、前列腺癌肿瘤组织中的microRNA-212表达显著低于癌旁组织。前列腺癌细胞系(DU145、PC3、22RV1和LNCaP)中microRNA-212较正常前列腺上皮细胞系(RWPE-1)中的表达低。结合临床资料分析,microRNA-212的表达与Gleason评分、脉管侵犯和淋巴结转移密切相关。2、在 DU145 和 PC3 两种细胞系中,转染 microRNA-212 mimics、microRNA-212 inhibitor或者NC阴型对照物。通过MTT实验和Transwell实验研究发现,转染了 microRNA-212 mimics的DU145和PC3细胞,其增殖率降低,同时mmicroRNA-212的上调抑制了 DU145和PC3细胞的迁移和侵袭能力。转染了microRNA-212 inhibitor的DU145和PC3细胞则表现出较强的增殖、迁移和侵袭能力。流式细胞仪分析结果表明,转染了 microRNA-212 mimics的DU145和PC3细胞的凋亡显著增加,转染了 microRNA-212 inhibitor的DU145和PC3细胞凋亡受到抑制。3、TargetScan 及 microRNAanda 分析显示,MAPK1 是 microRNA-212 可能的作用靶点。荧光素酶报告基因检测结果显示,microRNA-212显著降低了pmicroRNAGLO-MAPKl-3’-UTR Wt 的荧光素酶活性,表明 microRNA-212 能够直接靶向MAPK1的3’-UTR结合位点。在前列腺癌细胞DU145和PC3细胞中过表达microRNA-212 可显著抑制 MAPK1 的 mRNA(P<0.05)和蛋白(P<0.05)的表达,而下调microRNA-212可促进MAPK1的mRNA(P<0.05)和蛋白(P<0.05)的表达。结果表明,在前列腺癌中MAPK1是microRNA-212的直接靶基因。4、前列腺癌组织中MAPK1的mRNA水平及蛋白表达均显著高于其对应的癌旁组织。通过Spearman相关分析显示,MAPK1的mRNA表达与microRNA-212的表达呈负相关。在前列腺癌细胞DU145和PC3细胞中转染microRNA-212 mimics,同时转染MAPK1过表达载体(pcDNA3.1-MAPK1)或空载体(pcDNA3.1)。发现microRNA-212过表达引起的MAPK1下调可以被同时转染pcDNA3.1-MAPK1所抑制。MTT实验、Transwell实验以及流式细胞术研究表明,上调的MAPK1表达可逆转microRNA-212对前列腺癌细胞增殖、侵袭的抑制作用和促凋亡作用。5、在动物实验中,转染microRNA-212 mimics的DU145细胞在裸鼠体内的成瘤大小显著小于对照组(P<0.05),免疫组化染色提示转染microRNA-212 mimics的裸鼠组Ki67表达水平显著低于microRNA-NC组,Western blot实验提示转染microRNA-212 mimics组裸鼠肿瘤中MAPK1的表达水平更低(P<0.05)。结论:1.前列腺癌组织中microRNA-212表达显著下降,microRNA-212的表达与Gleason评分、脉管侵犯和淋巴结转移密切相关,microRNA-212能够抑制前列腺癌细胞的增殖、侵袭并促进前列腺癌细胞凋亡。2.在前列腺癌中MAPK1是microRNA-212的直接靶基因,microRNA-212通过调控MAPK1,抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭,促进前列腺癌细胞凋亡。