论文部分内容阅读
目的:大前庭水管综合征(large vestibular aqueduct syndrome,LVAS或enlarged vestibular aqueduct syndrome,EVAS)是以前庭导水管扩大伴有感音神经性聋(SNHL)为特征的一种常染色体隐性遗传性非综合征型听力障碍性疾病。为了系列研究EVAS的临床特征、基因突变检测、基因功能,我们对19例EVAS患者的临床、听力学及影像学特征进行分析;对相关基因SLC26A4、FOXI1行突变检测,发现特异和常见的突变图谱;通过构建突变体转染HEK293T细胞,观察SLC26A4基因突变对其编码的Pendrin蛋白的表达定位产生的影响,从而为进一步研究该基因突变的致病机理打下基础。方法:选择年长配合儿童及成人行纯音测听(PTA)检查,对不能主动配合纯音测听的幼儿,用声场行为听阈测试(BA);所有患者行听性脑干反应(ABR)和40Hz相关电位(40 AERP)测试、声导抗及耳声发射检查;ABR在最大给声无反应的患者,增加听觉稳态反应(ASSR)了解患者的残余听力。完成CT及MRI检查。应用聚合酶链反应(PCR)结合DNA直接测序方法,用DNASTAR软件中的EditSeq、SeqMan程序分析,对19例EVAS患者的SLC26A4基因的21个外显子、FOXI1的2个外显子及相邻的内含子区域进行突变检测和分析。将野生型、突变型SLC26A4连入真核表达载体pEGFP-N1中,与EGFP构成融合蛋白,转染HEK293T细胞,Western Blot检测蛋白表达;免疫荧光观察细胞定位,激光共聚焦显微镜拍照。结果:1.EVAS的典型表现是儿童时期的听力丧失,主要为SNHL,听力下降呈进行性或波动性,双耳受累者多见。听力水平多为中重度耳聋以上。听力受损以高频为主,听力曲线多呈下降型。特有的听力学表现即低频骨气导差及声诱发短潜伏期负反应ASNR在本组研究中分别占44.1%和42.1%。影像学检查是诊断的金标准,行人工耳蜗植入易出现“镫井喷”,但恰当处理不影响耳蜗植入。2.19例患者17例检出SLC26A4基因突变,突变率高达84.2%。12例为复合杂合突变,3例为纯合突变,2例杂合突变,2例无突变。共查及17种不同类型的SLC26A4基因的致病突变,13种为错义突变,2种剪接位点突变,1种无义突变和1种大片段缺失。其中16种为国内外已报道的突变,IVS7-2A＞G最多见,占34.4%。1种新发突变1716A＞T/F572L。对FOXI1基因检测发现两个多态:279 G＞A,1044T＞C。3.成功构建SLC26A4基因的野生型和S448X突变体pEGFPN1融合表达载体,命名为pEGFP N1 PDS WT和pEGFP N1 PDS S448X;并成功转染HEK293T细胞,Western blot检测PDS WT和PDS S448X蛋白的表达正确。免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜下发现S448X突变体绿色荧光局限在胞质,细胞膜没有清晰的绿色荧光显示。而大部分野生型细胞膜上有清晰的绿色荧光显示。结论:1.EVAS是以前庭导水管扩大伴有感音神经性聋(SNHL)为特征的一种隐性遗传性非综合征型听力障碍性疾病。临床听力学存在特征性改变,如低频骨气导差及声诱发短潜伏期负反应有助于发现该疾病,但诊断的金标准仍是影像学。行人工耳蜗植入易出现“镫井喷”,但恰当处理不影响耳蜗植入。2.本组EVAS患者,SLC26A4基因的突变率高达84.2%,说明SLC26A4基因突变与EVAS密切相关,同时提示如果我们在进行听力损失患者的基因筛查中首先发现SLC26A4基因突变,则高度预示该患者为EVAS患者,从基因检测中发现临床疾病。新发突变1716A＞T/F572L进一步丰富了中国人群的突变图谱,可以利用中国人IVS7-2A＞G的热点突变开展快速筛查工作。FOXI1作为SLC26A4的转录调控因子不是唯一的,EVAS的发生可能存在其他的致病因素。3.SLC26A4基因的S448X的突变,使突变蛋白局限于胞质,不能准确定位在细胞膜上。