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目的 研究丁苯酞对MPP~+诱导的SH-SY5Y细胞增殖能力、凋亡及氧化应激的影响;探讨丁苯酞对帕金森病体外细胞模型的保护作用是否与ROS介导MLK3通路有关。方法 将人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞接种于细胞培养瓶中采用DMEM/F12=1:1的培养基进行培养。实验分为五组:正常对照组、MPP~+模型组、丁苯酞+MPP~+组、NAC+MPP~+组、URMC-099+MPP~+组。空白对照组:完全培养基正常培养SH-SY5Y细胞,培养整个过程不加任何药物进行干预;MPP~+模型组:1mmol/L MPP~+培养细胞24小时;丁苯酞+MPP~+组:10μmol/L丁苯酞预处理细胞3小时后,加入MPP~+培养细胞至24小时;NAC+MPP~+组:200μmol/L NAC预处理细胞3小时后,加入MPP~+继续培养至24小时;URMC-099+MPP~+组:200nmol/L URMC-099预处理细胞3小时后,加入MPP~+继续培养至24小时。噻唑蓝比色法检测各组细胞相对存活率;倒置相差显微镜观察各组细胞形态学变化;Annexin-V/PI双染流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Hoechst33342染色观察各组细胞凋亡形态;DCFH-DA荧光染色检测各组细胞内ROS;采用Western blotting检测各组细胞p-MLK3、p-JNK和p-ERK1/2蛋白表达量。结果 1噻唑蓝比色法结果显示:MPP~+模型组细胞相对存活率明显低于正常对照组(P<0.05),丁苯酞+MPP~+组、NAC+MPP~+组与URMC-099+MPP~+组的细胞相对存活率明显高于MPP~+模型组(P<0.05)。2倒置相差显微镜观察发现:正常对照组呈三角形或梭形,贴壁细胞数较多,细胞之间突起结构明显;MPP~+模型组细胞呈圆形或椭圆形,突起回缩,贴壁不稳,多悬浮生长;丁苯酞+MPP~+组、NAC+MPP~+组和URMC-099+MPP~+组较MPP~+模型组贴壁细胞数增多,细胞突起明显,形态与正常对照组形态相似。3 Annexin-V/PI双染流式细胞术检测各组细胞凋亡率结果显示:MPP~+模型组细胞凋亡率明显高于正常对照组(P<0.05);丁苯酞+MPP~+组、NAC+MPP~+组和URMC-099+MPP~+组细胞凋亡率均明显低于MPP~+模型组(P<0.05)。4 Hoechst33342凋亡染色发现:正常对照组细胞核呈弥漫均匀的蓝色荧光;MPP~+模型组细胞染色不均匀,细胞凋亡明显,可见浓染致密的颗粒荧光及块状荧光;丁苯酞+MPP~+组、NAC+MPP~+组和URMC-099+MPP~+组凋亡染色细胞较少。5 DCFH-DA荧光染色结果显示:MPP~+模型组平均荧光强度明显高于正常对照组(P<0.05);丁苯酞+MPP~+组、NAC+MPP~+组和URMC-099+MPP~+组平均荧光强度均明显低于MPP~+模型组(P<0.05)。6 Western blotting检测结果显示:MPP~+模型组与正常对照组比较,p-MLK3、p-JNK蛋白表达明显增加,p-ERK1/2蛋白表达明显降低(P<0.05);丁苯酞+MPP~+组、NAC+MPP~+组和URMC-099+MPP~+组与MPP~+模型组比较,p-MLK3、p-JNK蛋白表达明显降低,p-ERK1/2蛋白表达明显增高(P<0.05)。结论 1丁苯酞可对抗MPP~+毒性作用,提高MPP~+诱导的SH-SY5Y细胞增殖活性,降低氧化应激水平和细胞凋亡,对神经元有一定的保护作用;2丁苯酞可抑制ROS介导的MLK3通路,综合调控下游p-ERK1/2和p-JNK蛋白表达,ROS/MLK3信号通路是研究丁苯酞神经保护作用的新靶点。