选题背景:在隐球菌病的研究中亟待解决的问题是对隐球菌的致病机制和耐药机制还缺乏足够的了解。近年来生物膜(biofilm)对真菌致病力的作用日益为人们所重视。研究发现真菌生物膜对抗真菌药物的敏感性比游离状态下低30-2000倍。那么,生物膜形成的相关机制是什么?有哪些基因影响了生物膜的形成?真菌生物膜的研究还处于起步阶段,还有大量未解之谜。本课题选取了有代表性的A血清型新生隐球菌H99 MATα型菌株和PMT4基因作为研究对象。Pmt4蛋白对于真菌分泌蛋白和部分膜蛋白的修饰极其重要,缺乏pmt酶活性可导致菌株生长率下降、细胞壁不稳定甚至死亡。已发表的研究显示,PMT基因对白念珠菌生物膜的形成和生物膜介导的耐药至关重要。鉴于新生隐球菌和白念珠菌的诸多相似性,我们可以推测,PMT基因很可能在新生隐球菌的生物膜形成及其介导的耐药上起重要作用。由于这一基因编码的蛋白存在于真菌内,植物细胞则无,它与哺乳动物细胞内的类似酶在性质和催化作用上有着很大的不同。因此对其的进一步研究也有可能为研发新的抗真菌药物提供靶点。另外,在隐球菌生物膜的研究中缺乏实用的体内模型,因此本课题除采用已有的体外模型外,还构建了一种新的基于血管内插管的动物模型。研究目的:1.构建新生隐球菌H99的PMT4基因缺陷株。2.构建新的新生隐球菌生物膜的动物模型。3.观察新生隐球菌H99野生株和PMT4缺陷株在生物膜形成方面的差异。4.观察新生隐球菌H99野生株和PMT4缺陷株所形成的生物膜在抗真菌药物敏感性方面的差异。研究方法:1.构建新生隐球菌H99的PMT4基因缺陷株。使用PCR介导的长侧翼同源重组法来进行PMT4基因的敲除工作,用一个G418抗性基因替换掉H99菌株基因组中的PMT4基因。初步筛选采用含G418的YPD平板进行,所得阳性转化子分别进行PCR验证。PCR验证通过的阳性转化子经基因测序验证。2.构建新的新生隐球菌生物膜的动物模型。采用基础培养基、聚苯乙烯96孔板内孵育的方法建立体外模型。采用兔颈外静脉插管并在导管内置聚苯乙烯薄膜的方法建立动物模型。3.观察新生隐球菌H99野生株和PMT4缺陷株在生物膜形成方面的差异。采用倒置相差显微镜和共聚集激光扫描显微镜观察生物膜的大体形态和结构。采用比较集落形成单位(CFU)数量的方法比较H99野生株和PMT4缺陷株生物膜中有增殖活性的细胞比例。4.观察新生隐球菌H99野生株和PMT4缺陷株所形成的生物膜在抗真菌药物敏感性方面的差异。用美国CLSI的M27A2微量稀释法对H99野生株和PMT4缺陷株游离细胞以及它们的生物膜细胞进行药敏实验。用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定H99野生株及其PMT4缺陷株生物膜代谢活性,并以此反应这两种菌株在体内外模型中形成的生物膜对抗真菌药物的敏感性。根据体外模型的实验结果决定动物模型中采用的药物浓度。结果:1.构建新生隐球菌H99的PMT4基因缺陷株。G418平板培养、对最终获得的12号转化子的PCR验证以及对其基因组相关基因的测序分析均证明12号转化子的PMT4基因已被成功敲除。2.构建新的新生隐球菌生物膜的动物模型。实验证实H99野生株及其PMT4缺陷株均可在基础培养基加96孔板的体外模型和新构建的血管内插管加导管内置聚苯乙烯膜的动物模型中形成生物膜。证实本课题采用的体外模型和新的动物模型可用于生物膜的研究。3.新生隐球菌H99野生株和PMT4缺陷株在生物膜形成方面的差异。新生隐球菌H99野生株及其PMT4缺陷株在动物模型中形成的生物膜与体外模型中所形成的生物膜在形成过程和大体形态方面非常相似,也是在24小时后开始成熟。但后者同时期生物膜的细胞数量和生物膜厚度比前者小。用倒置显微镜和共聚集激光扫描显微镜均观察到PMT4缺陷株所形成的生物膜在接种24小时后出现大量类似假菌丝样的结构。在同等数量的接种细胞中,PMT4缺陷株生物膜细胞的集落形成单位数明显少于H99野生株生物膜细胞。4.新生隐球菌H99野生株和PMT4缺陷株所形成的生物膜在抗真菌药物敏感性方面的差异。M27A2微量稀释法药敏实验发现FCZ、AmB、5-FC、ITR四种抗真菌药物对H99野生株及其PMT4缺陷株游离细胞的MIC值(μg/ml)分别是4、1、4、≤0.125和1、0.25、0.5、≤0.125;对生物膜细胞的MIC值(μg/ml)分别是4、2、8、≤0.125和2、0.125、4、≤0.125。体外模型生物膜细胞的MTT检测发现,这四种药物使浊度下降80%所需的最低药物浓度(μg/ml)(这一指标类似上述MIC值)在H99野生株生物膜和PMT4缺陷株生物膜中分别是≥64、32、≥64、16和2、0.5、4、1。动物模型生物膜细胞的MTT检测发现,在64μg/ml FCZ作用下,与各自的空白对照相比,PMT4缺陷株生物膜细胞的代谢活性抑制率为96.7%,H99野生株生物膜细胞为8.7%。结论:通过PCR验证和基因测序证实12号转化子中的PMT4基因确实被敲除了,这一PMT4缺陷株,可用于对PMT4基因进一步的研究。首次利用兔中心静脉插管的方式成功构建了隐球菌血管内插管的动物模型,可作为研究平台用于模拟临床最为常见的植入物表面生物膜形成的情况,对于隐球菌生物膜的研究有着重要意义。首次采用导管内置入聚苯乙烯薄膜的方法构建动物模型,导管内覆的聚苯乙烯薄膜可取出,避免了导管内生物膜体内模型只能在共聚集激光扫描显微镜下利用Z轴成像的方式进行观察的弊端,使得导管内生物膜也可直接在普通光镜下观察。实验结果显示无论是H99野生株还是PMT4缺陷株所形成的生物膜均在24小时后进入成熟期。接种48小时后进入相对的稳定期。PMT4缺陷株各时期生物膜的细胞量均少于H99野生株。另外发现成熟的PMT4缺陷株生物膜中具有增殖活性的细胞的比例小于同时期的野生株生物膜。这意味着PMT4缺陷株形成的生物膜向外释放菌细胞、扩大感染范围的能力弱于野生株。在生物膜结构方面,相较于H99野生株生物膜,PMT4缺陷株生物膜的一个显著特点是进入成熟期后产生具有大量的假菌丝样结构。这可能与PMT4变异株的细胞壁缺陷有关,但为何进入成熟期才出现尚不清楚。药敏实验显示,PMT4缺陷株游离细胞对抗真菌药物的敏感性比野生株稍高,这可能也与其细胞壁的缺陷有关。对隐球菌生物膜细胞进行的M27A2药敏显示其对药物的敏感性与游离细胞差异不大,可能是由于生物膜细胞在从生物膜中分离出来在营养丰富的培养基中长时间培养又逐渐恢复了游离细胞生物学特性的缘故。由此可见,将生物膜细胞分离出来成为悬浮细胞后再进行常规M27A2药敏实验并不能反映生物膜本身对抗真菌药物的真实敏感性。体内外模型生物膜细胞的MTT检测均表明,H99野生株生物膜细胞比PMT4缺陷株生物膜细胞对抗真菌药物的抵抗能力强。在体外模型中, PMT4缺陷株生物膜细胞对不同的抗真菌药物的敏感性比野生株高16-64倍。在体内模型中,同等药物浓度下,PMT4缺陷株生物膜细胞的代谢活性几乎被完全抑制,而野生株生物膜细胞却不受影响。这些结果提示PMT4基因对于新生隐球菌生物膜的耐药特性是至关重要的,PMT4基因的缺失可导致新生隐球菌生物膜耐药性几乎完全丧失。由于真菌的PMT4基因与哺乳动物的类似基因差异很大,因此PMT4基因及其编码的酶有可能成为新的抗真菌药物的作用靶点。