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背景与目的：
早发性卵巢功能不全（Premature ovarian insufficiency，POI）是指女性在40岁之前出现卵巢功能减退，其特征为月经稀发或闭经、雌激素水平下降以及卵泡刺激素(FSH)水平升高(＞25IU/L)。随着全球癌症发病率逐步上升，医源性POI成为科学家们关注的焦点。化疗作为恶性肿瘤的常规治疗手段，对卵巢功能及结构均有显著的损害，严重影响年轻恶性肿瘤患者的生殖及心理健康。目前尚无有效治疗手段从根本上治疗化疗诱导的卵巢功能不全。因此，寻求新的治疗手段是当下亟待解决的问题。
微小核糖核酸(miRNAs)是一类由内源基因编码的长度为22-25个核苷酸的非编码单链小RNA，通过与靶基因mRNA的3-UTR特异性碱基配对，调控靶基因的转录翻译，从而参与多种疾病的发生。miR-21是哺乳动物体内最早被发现的miRNAs之一，它在卵巢中表达增加，与原始卵泡的形成、闭锁以及卵巢颗粒细胞功能调节密切相关。目前，miR-21与化疗性卵巢功能不全的关系尚未阐明，调控miR-21表达水平可能为治疗化疗性卵巢功能不全提供新思路。
本课题分为细胞实验与动物实验两部分:1、细胞实验:采用磷酰胺氮芥(Phosphoramide mustard，PM)诱导卵巢颗粒细胞(Granulosa cells，GCs)凋亡并转染过表达miR-21慢病毒载体，通过检测GCs凋亡情况和靶基因PTEN、PDCD4的表达水平，探讨miR-21对PM诱导GCs凋亡的影响。2、动物实验:采用环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)构建化疗性卵巢功能不全大鼠模型，双侧卵巢注射过表达miR-21慢病毒载体，通过检测卵巢结构及内分泌功能指标、GCs凋亡和靶基因PTEN、PDCD4表达情况，探讨miR-21在化疗性卵巢功能不全大鼠模型中治疗作用及可能机制，为其应用于化疗性卵巢功能不全的临床治疗提供理论依据。
方法：
1、构建过表达miR-21慢病毒载体（LV-miR-21）:将miR-21前体引物克隆入pLVX-shRNA2质粒中，经限制性内切酶Bam HⅠ与Eco RⅠ双酶切后，使用T4DNA连接酶连接has-miR-21-5p与酶切后的pLVX-shRNA2片段。使用测序对酶切产物进行鉴定，将鉴定为阳性的重组pLVX-shRNA2-miR-21过表达载体质粒转染至HEK-293T细胞，获得miR-21过表达miR-21慢病毒载体(LV-miR-21)。
2、细胞实验:分离、培养及鉴定GCs，将细胞分为3组:空白组、PM组和miR-21组。空白组不作处理，PM组加入PM诱导GCs凋亡，miR-21加入PM后与LV-miR-21共培养48小时。使用AnnexinⅤ/PI法测定各组GCs凋亡率，qRT-PCR检测GCs中miR-21、PTEN和PDCD4的表达水平，Westernblot检测GCs中PTEN和PDCD4蛋白表达水平。
3、动物实验:雌性Wistar大鼠分为4组:空白对照组、模型组、LV组和miR-21组。空白对照组不予处理，后3组大鼠使用CTX腹腔注射建立化疗性卵巢功能不全大鼠模型，建模结束后，模型组不作处理，LV组及miR-21组分别每侧卵巢各注射1×106空载体和LV-miR-21。观察大鼠动情周期，各组均于实验前、完成注射后第1、15、30、45、60天使用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测E2水平，免疫放射法(RIA)测定FSH水平;不同时间点分批处死大鼠后取双侧卵巢称重，一侧卵巢石蜡包埋进行组织切片，HE染色计数各级卵泡、TUNEL法测定GCs凋亡率;另一侧卵巢用于qRT-PCR检测miR-21及其靶基因PTEN和PDCD4水平、Western blot法检测PTEN和PDCD4蛋白水平。
结果：
1、成功构建LV-miR-21:LV-miR-21重组质粒测序结果与miR-21基因序列一致。
2、细胞实验:miR-21组GCs凋亡率(27.00±2.45)明显低于PM组(33.40±4.22)(P＜0.05);miR-21水平(3.95±0.17)明显高于空白组(0.94±0.08)和PM组(0.65±0.08)，PTEN和PDCD4mRNA以及蛋白水平明显低于PM组（P＜0.05）。
3、动物实验:完成注射后第60天，miR-21组有64％大鼠恢复规律动情周期;完成注射后第15、30、45、60天，miR-21组的E2水平均高于模型组和LV组，而FSH水平则低于同时间点的模型组和LV组（P＜0.05）;完成注射后第15、30、45、60天，miR-21组大鼠GCs凋亡率均显著低于模型组和LV组(P＜0.05);完成注射后第30、45、60天，miR-21组大鼠卵巢重量均显著高于模型组和LV组（P＜0.05）;完成注射后第45、60天，miR-21组各级卵泡数均多于模型组和LV组(P＜0.05);完成注射后第1、15、30、45、60天，miR-21组的miR-21水平较模型组和LV组增加，而完成后第15、30、45、60天，PTEN、PDCD4的mRNA以及蛋白表达水平则较模型组和LV组显著下降（P＜0.05）。
结论：
1、miR-21可抑制磷酰胺氮芥诱导的卵巢颗粒细胞凋亡;
2、miR-21能够部分修复化疗性卵巢功能不全大鼠模型中卵巢结构和内分泌功能并抑制GCs凋亡，其机制可能与负调控靶基因PTEN及PDCD4表达密切相关。
早发性卵巢功能不全（Premature ovarian insufficiency，POI）是指女性在40岁之前出现卵巢功能减退，其特征为月经稀发或闭经、雌激素水平下降以及卵泡刺激素(FSH)水平升高(＞25IU/L)。随着全球癌症发病率逐步上升，医源性POI成为科学家们关注的焦点。化疗作为恶性肿瘤的常规治疗手段，对卵巢功能及结构均有显著的损害，严重影响年轻恶性肿瘤患者的生殖及心理健康。目前尚无有效治疗手段从根本上治疗化疗诱导的卵巢功能不全。因此，寻求新的治疗手段是当下亟待解决的问题。
微小核糖核酸(miRNAs)是一类由内源基因编码的长度为22-25个核苷酸的非编码单链小RNA，通过与靶基因mRNA的3-UTR特异性碱基配对，调控靶基因的转录翻译，从而参与多种疾病的发生。miR-21是哺乳动物体内最早被发现的miRNAs之一，它在卵巢中表达增加，与原始卵泡的形成、闭锁以及卵巢颗粒细胞功能调节密切相关。目前，miR-21与化疗性卵巢功能不全的关系尚未阐明，调控miR-21表达水平可能为治疗化疗性卵巢功能不全提供新思路。
本课题分为细胞实验与动物实验两部分:1、细胞实验:采用磷酰胺氮芥(Phosphoramide mustard，PM)诱导卵巢颗粒细胞(Granulosa cells，GCs)凋亡并转染过表达miR-21慢病毒载体，通过检测GCs凋亡情况和靶基因PTEN、PDCD4的表达水平，探讨miR-21对PM诱导GCs凋亡的影响。2、动物实验:采用环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)构建化疗性卵巢功能不全大鼠模型，双侧卵巢注射过表达miR-21慢病毒载体，通过检测卵巢结构及内分泌功能指标、GCs凋亡和靶基因PTEN、PDCD4表达情况，探讨miR-21在化疗性卵巢功能不全大鼠模型中治疗作用及可能机制，为其应用于化疗性卵巢功能不全的临床治疗提供理论依据。
方法：
1、构建过表达miR-21慢病毒载体（LV-miR-21）:将miR-21前体引物克隆入pLVX-shRNA2质粒中，经限制性内切酶Bam HⅠ与Eco RⅠ双酶切后，使用T4DNA连接酶连接has-miR-21-5p与酶切后的pLVX-shRNA2片段。使用测序对酶切产物进行鉴定，将鉴定为阳性的重组pLVX-shRNA2-miR-21过表达载体质粒转染至HEK-293T细胞，获得miR-21过表达miR-21慢病毒载体(LV-miR-21)。
2、细胞实验:分离、培养及鉴定GCs，将细胞分为3组:空白组、PM组和miR-21组。空白组不作处理，PM组加入PM诱导GCs凋亡，miR-21加入PM后与LV-miR-21共培养48小时。使用AnnexinⅤ/PI法测定各组GCs凋亡率，qRT-PCR检测GCs中miR-21、PTEN和PDCD4的表达水平，Westernblot检测GCs中PTEN和PDCD4蛋白表达水平。
3、动物实验:雌性Wistar大鼠分为4组:空白对照组、模型组、LV组和miR-21组。空白对照组不予处理，后3组大鼠使用CTX腹腔注射建立化疗性卵巢功能不全大鼠模型，建模结束后，模型组不作处理，LV组及miR-21组分别每侧卵巢各注射1×106空载体和LV-miR-21。观察大鼠动情周期，各组均于实验前、完成注射后第1、15、30、45、60天使用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测E2水平，免疫放射法(RIA)测定FSH水平;不同时间点分批处死大鼠后取双侧卵巢称重，一侧卵巢石蜡包埋进行组织切片，HE染色计数各级卵泡、TUNEL法测定GCs凋亡率;另一侧卵巢用于qRT-PCR检测miR-21及其靶基因PTEN和PDCD4水平、Western blot法检测PTEN和PDCD4蛋白水平。
结果：
1、成功构建LV-miR-21:LV-miR-21重组质粒测序结果与miR-21基因序列一致。
2、细胞实验:miR-21组GCs凋亡率(27.00±2.45)明显低于PM组(33.40±4.22)(P＜0.05);miR-21水平(3.95±0.17)明显高于空白组(0.94±0.08)和PM组(0.65±0.08)，PTEN和PDCD4mRNA以及蛋白水平明显低于PM组（P＜0.05）。
3、动物实验:完成注射后第60天，miR-21组有64％大鼠恢复规律动情周期;完成注射后第15、30、45、60天，miR-21组的E2水平均高于模型组和LV组，而FSH水平则低于同时间点的模型组和LV组（P＜0.05）;完成注射后第15、30、45、60天，miR-21组大鼠GCs凋亡率均显著低于模型组和LV组(P＜0.05);完成注射后第30、45、60天，miR-21组大鼠卵巢重量均显著高于模型组和LV组（P＜0.05）;完成注射后第45、60天，miR-21组各级卵泡数均多于模型组和LV组(P＜0.05);完成注射后第1、15、30、45、60天，miR-21组的miR-21水平较模型组和LV组增加，而完成后第15、30、45、60天，PTEN、PDCD4的mRNA以及蛋白表达水平则较模型组和LV组显著下降（P＜0.05）。
结论：
1、miR-21可抑制磷酰胺氮芥诱导的卵巢颗粒细胞凋亡;
2、miR-21能够部分修复化疗性卵巢功能不全大鼠模型中卵巢结构和内分泌功能并抑制GCs凋亡，其机制可能与负调控靶基因PTEN及PDCD4表达密切相关。