宫颈癌(cervical cancer)是一种常见的女性生殖道恶性肿瘤,具有较高的发病率和死亡率。手术结合放化疗是目前宫颈癌的综合治疗模式,但对于晚期患者已失去手术机会,而放化疗对机体正常组织的损伤使一些患者无法耐受。基因治疗可同时阻断多个癌基因的表达,效果显著,且具有许多传统方法无法比拟的特点和优势,可作为手术和放化疗的补充,为宫颈癌的治疗开辟了一条新的途径。叉头框蛋白(forkhead box protein,FOX)是一类转录因子,共分为19个亚家族,分别被命名为FOXA~S,其中O亚家族(FOXO)是研究最为深入的一类。人FOXO亚家族有4个成员,即FOXO1、FOXO3、FOXO4和FOXO6,其中FOXO1蛋白广泛表达于几乎所有组织,调控着细胞调亡及抗氧化应激等过程,是一种重要的肿瘤抑制因子。有研究表明,微RNA(micro RNA,mi RNA)作为一种转录后调节因子,可调控FOXO1基因的表达,参与细胞分化、增殖、凋亡等诸多生物学过程,提示mi RNA可能作为癌基因或抑癌基因在肿瘤的发生发展中起重要作用。mi RNA是高等真核生物中的一类长约20~23个核苷酸的小分子单链RNA,大量研究证实,肿瘤组织和正常组织中的mi RNA表达谱存在显著差异。micro RNA-135b(mi R-135b)最早发现于鼠,随后被证实在脊椎动物中广泛存在。mi R-135b编码基因为MIRN135B,定位于1q32.1,其前体由70个核苷酸组成,在胞质中经Dicer酶剪切生成长约21~24个核苷酸的成熟序列。目前已有研究表明mi R-135b与多种肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等有关,但mi R-135b在宫颈癌中相关的生物学作用尚未见报道。本研究通过检测mi R-135b在宫颈癌细胞系中的表达、mi R-135b在宫颈癌细胞增殖中的作用、mi R-135b在宫颈癌细胞凋亡中的作用、mi R-135b在宫颈癌细胞迁移、侵袭中的作用、mi R-135b对宫颈癌细胞增殖、凋亡及侵袭转移作用的分子机制等五部分内容的研究,探讨mi R-135b对宫颈癌细胞生物学功能的影响及其机制,弥补了mi R-135b在宫颈癌生物学功能研究领域的空白,可能成为宫颈癌基因治疗的一个新的靶点,为晚期及复发转移的宫颈癌患者带来希望。目的:探讨mi R-135b对宫颈癌细胞增殖、凋亡、迁移等生物学功能的影响,并对其影响的机制进行研究,为宫颈癌的治疗开辟一条新的途径。方法:1、通过实时荧光定量PCR方法检测mi R-135b在六种宫颈癌细胞系(C33A、HCC94、He La、HT-3、Si Ha、Ca SKi)及正常宫颈上皮细胞系(End1/E6E7)中表达的差异。2、通过细胞转染技术,将mi R-135b抑制物(anti-mi R-135b)转染宫颈癌细胞,同时转染无意义对照序列(anti-mi R-NC)作为阴性对照,空白对照组细胞不做任何处理。采用MTT法检测细胞活性;Brd U-ELISA技术检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞周期的变化;实时荧光定量PCR及western blot检测细胞周期相关调节蛋白(p21、p27及cyclin D1)m RNA及蛋白的表达变化。3、将anti-mi R-135b或anti-mi R-NC转染宫颈癌细胞,通过Hoechst 33258染色法及流式细胞术(Annexin V/PI染色法)检测细胞凋亡情况;western bolt检测细胞色素C的释放;Western blot检测cleaved caspase-3,8,9及Bax/Bcl-2蛋白的表达情况;JC-1染色检测线粒体膜电位变化。4、将anti-mi R-135b或anti-mi R-NC转染宫颈癌细胞,利用transwell侵袭实验观察mi R-135b对宫颈癌细胞侵袭能力的影响;划痕实验观察mi R-135b对宫颈癌细胞迁移能力的影响;western blot检测转移相关蛋白MMP-2、MMP-9的表达变化。5、在mi R-135b对宫颈癌细胞增殖、凋亡及侵袭转移作用分子机制的研究中,首先通过生物信息学软件预测mi R-135b作用的靶基因,将anti-mi R-135b或anti-mi R-NC转染宫颈癌细胞,采用实时荧光定量PCR及western blot分别检测靶基因m RNA及蛋白的表达,进一步验证靶基因,并通过双荧光素酶报告基因检测技术寻找对靶基因作用的位点;其次构建靶基因si RNA(实验组)及相应的对照序列si RNA-control(对照组),分别与anti-mi R-135b共转染细胞,通过Brdu-ELISA检测细胞的增殖情况,实时荧光定量PCR及western blot分别检测p21、p27及cyclin D1的m RNA及蛋白表达水平;采用western blot检测cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9及Bax/Bcl-2的表达;利用westernblot检测细胞中细胞色素C的释放情况;通过western blot检测MMP-2及MMP-9的表达情况。结果:1、mi R-135b在宫颈癌细胞系中的表达与人正常宫颈上皮细胞系相比,mi R-135b在六种宫颈癌细胞系中表达均上调,尤其在Si Ha细胞及HT-3细胞中表达明显增多。2、mi R-135b在宫颈癌细胞增殖中的作用(1)与转染anti-mi R-NC组相比,转染anti-mi R-135b组细胞活性明显减弱;(2)与转染anti-mi R-NC组相比,转染anti-mi R-135b组细胞增殖能力明显降低;(3)与转染anti-mi R-NC组相比,当转染anti-mi R-135b的浓度达15n M时,即可对细胞周期产生明显影响,使G0/G1期细胞百分比明显增多,而S期细胞百分比显著减少;(4)与转染anti-mi R-NC组相比,转染anti-mi R-135b组p21、p27的m RNA及蛋白表达水平均明显升高,而cyclin D1的m RNA及蛋白表达水平明显减少。3、mi R-135b在宫颈癌细胞凋亡中的作用(1)与转染anti-mi R-NC组相比,转染anti-mi R-135b组凋亡细胞明显增加,且随着anti-mi R-135b浓度升高,细胞凋亡数量增加,呈浓度依赖性;(2)抑制mi R-135b促进细胞色素C从线粒体释放入胞浆,且随着anti-mi R-135b浓度增加,线粒体内的细胞色素C含量呈下降趋势,而胞浆内细胞色素C的含量呈上升趋势;(3)抑制mi R-135b后,减少了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,增加了促凋亡蛋白Bax的表达,Bax/Bcl-2比率增高;细胞内可以检测到活化形式的Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8及Cleaved caspase-9表达,且随anti-mi R-135b浓度升高,Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8及Cleaved caspase-9表达量增加;(4)随着anti-mi R-135b增加,绿色荧光比例逐渐升高,即JC-1以单体形式存在的比例升高,线粒体膜电位下降。4、mi R-135b在宫颈癌细胞迁移、侵袭中的作用(1)与转染anti-mi R-NC组相比,转染anti-mi R-135b组的相对细胞转移量明显减少;(2)转染anti-mi R-135b组12小时、24小时及48小时划痕的宽度与相应时间的anti-mi R-NC组相比均增宽,细胞迁移率均明显下降,且转染anti-mi R-135b浓度越大,细胞迁移率越低;(3)抑制mi R-135b后,MMP-2及MMP-9表达减少,且呈浓度依赖性。5、mi R-135b对宫颈癌细胞增殖、凋亡及侵袭转移作用的分子机制研究(1)根据micro RNA作用靶点预测软件Target Scan,发现FOXO1的3’UTR有与mi R-135b潜在的结合位点,预测FOXO1可能为mi R-135b的作用靶基因;(2)转染anti-mi R-135b后,细胞内FOXO1的m RNA及蛋白表达均明显增多;(3)p Mir-FOXO1-3’UTRWT野生型组中,与转染anti-mi R-NC组相比,转染anti-mi R-135b组荧光素酶活性比率明显升高;而在p Mir-FOXO1-3’UTR MUT突变型组中,anti-mi R-NC组与anti-mi R-135b组的荧光素酶活性比率无明显差异;(4)与对照组相比,实验组细胞增殖能力增强,p21、p27的m RNA及蛋白表达水平下调,而cyclin D1的m RNA及蛋白表达水平上调;实验组cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9的相对表达量较对照组均明显减少;实验组Bax蛋白的相对表达量较对照组明显减少,Bcl-2蛋白的相对表达量较对照组明显增多;实验组线粒体内细胞色素C的相对表达量较对照组明显增多,胞浆内细胞色素C的相对表达量较对照组明显减少;实验组MMP-2及MMP-9的相对表达量较对照组均明显增多。结论:本研究表明FOXO1为mi R-135b作用的靶基因,且其作用靶点位于FOXO1的3’UTR。mi R-135b是通过靶向FOXO1基因参与对宫颈癌细胞增殖、凋亡及侵袭转移能力的调控。下调mi R-135b后,解除了对FOXO1的抑制,从而抑制了宫颈癌细胞增殖,诱导宫颈癌细胞凋亡,降低了宫颈癌细胞的侵袭转移能力,说明mi R-135b在宫颈癌发展过程中起到致癌基因的作用,可能成为宫颈癌基因治疗的一个新的靶点。