禽流行性感冒(Avian influenza,AI),简称禽流感,又名真性鸡瘟或欧洲鸡瘟,是由甲型流感病毒株的某些亚型引起的急性呼吸道传染病。以急性败血性死亡到无症状带毒等多种病征为特点。禽流感病毒粒子表面的血凝素和神经氨酸酶具有亚型的特性,自1997年禽甲型流感病毒H5N1感染人类之后,相继有H9N2,H7N7亚型感染人类和H5N1再次感染人类的报道,引起了世人的广泛关注。聚合酶链式反应(PCR)是当对全基因序列了解,或者只了解待要扩增片段两端(5′端、3′端)的序列时,以2n(n为PCR反应的循环次数)的指数方式快速地扩增目的基因DNA的分子生物学实验方法。PCR扩增具有高效、特异、高度忠实于模板,扩增产物纯度高,可以不经纯化直接用于下游研究工作等特点。从20世纪90年代PCR技术发明后至今,仍是一种重要的体外扩增DNA的手段。因此,通过PCR技术来快速诊断禽流感病毒的存在及其所属基因型是检测防治禽流感的理想方法之一。本试验以AIV的H5、H7、H9三个亚型的培养物提取RNA并反转录,进行RT-PCR特异性扩增。结果表明,各单项RT-PCR扩增产物与已经设计好的3对引物之间的序列大小一致(H5、H7和H9的扩增片段大小分别为427bp、228bp、830bp)。在已经建立好的H5与H7、H5与H9、H7与H9的二联RT-PCR的基础上,成功组建H5、H7、H9三种AIV病毒亚型的三联RT-PCR技术。然后,通过长期的周期性检测摸索出当PCR的预混合体系不同时,各种可能的混合体系在不同的保存条件下哪种体系及其保存方式最合理,并将其做合理的优化设计,最终开发出可以在短时间乃至1～2h内即可完成对待检样品的检测并能成功断定出AIV的存在与否及其血凝素抗原所属基因亚型的快速诊断试剂盒,从而有利于科研或疾病防治的开展。结果表明当25微升PCR体系中Buffer2.5μL、dNTP2μL、H5上下游引物分别加入0.2μL、H7上下游引物分别加入0.4μL、H9上下游引物分别加入0.6μL,各模板加入2μL时多连PCR对三种基因型的禽流感病毒的检测能力最为显著,并经特异性和灵敏性实验证明,本方法具有高度的特异性和灵敏性。然后通过长时间下不同PCR预混体系和保存条件的测试后,最终优化设计得出PCR混合体系为Buffer+二馏水+dDNTP +rtaqE+上下游引物,该混合体系在-20℃条件下可长期保存并保证该多连PCR检测体系的检测效果,进而最终设计出可实际投放生产使用的禽流感H5、H7、H9多重联检RT-PCR诊断试剂盒。