根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种植物致病菌,能感染绝大多数双子叶植物与少数单子叶植物。农杆菌将自身携带的Ti质粒上的T-DNA（transferred DNA）单链拷贝分子—ssT-DNA,即T-strand,整合至植物细胞基因组中,T-DNA上原癌基因的表达使植物产生冠瘿瘤。在T-strand的运输过程中,农杆菌也同时将自身合成的毒性蛋白分泌至植物细胞,帮助T-strand从植物细胞质运送至细胞核,并参与其整合过程。为了了解农杆菌侵染对拟南芥基因转录的影响,揭示拟南芥细胞对农杆菌毒性蛋白与原癌基因表达反应的机制,以及研究农杆菌毒性蛋白的应用,我们使用打离差方法重新分析Deeken等人（2006）和Lee等人（2009）的基因芯片数据,比较拟南芥受伤花梗接种农杆菌GV3101后第6天与第3小时以及冠瘿瘤成熟期与幼龄期的光合作用、呼吸作用、胁迫反应、激素代谢、核苷酸、RNA、DNA、蛋白质、脂类代谢和信号传导等代谢途径相关基因的转录变化差异,并且表达农杆菌VirD2和VirE2蛋白。主要结果如下:1.接种GV3101后基因转录的时序变化明显不同拟南芥花梗受伤后第6天与第3小时相比,有3885个基因的转录发生变化,其中3521个转录上调,364个转录下调。而受伤且接种农杆菌GV3101后的第6天与第3小时相比,共有4651个基因发生差异转录,其中4381个转录下调,270个转录上调;两种情形下只有1045个差异转录基因是相同的。1.1 GV3101的处理中,光合作用、呼吸作用等主要基础代谢途径与通路的转录下降基因数明显减少拟南芥花梗受伤后第6天与第3小时相比,光合作用途径中有33个基因发生了差异转录,其中2个上升,31个下降。而接种农杆菌GV3101后第6天与第3小时相比,只有7个基因的转录发生变化,其中1个上升,6个下降。分析表明,光反应的转录变化最显著。对照中有20个转录下降的基因参与光反应,而GV3101处理时只有6个。受伤后第6天与第3小时相比,在糖酵解、氧化磷酸化戊糖、三羧酸循环、线粒体电子传递等呼吸代谢途径中,分别有17、12、31和45个基因发生差异转录,而接种农杆菌GV3101后第6天与第3小时相比,则分别有7、1、17和10个基因发生转录变化,其水平全部下降。对照中,除了有两个氧化磷酸化戊糖代谢相关基因转录上升外,其余的转录也全部下降。1.2接种农杆菌GV3101后第6天与第3小时相比,转录下调的NB-LRR型抗病蛋白编码基因明显增加拟南芥花梗受伤后第6天与第3小时相比,生物胁迫相关基因中有50个发生了转录变化,其中39个水平下降,11转录水平上升。而接种农杆菌GV3101的条件下,则有119个生物胁迫相关基因的转录发生变化,其中105个转录下降,14个上升。两种情形下只有10个转录变化基因是相同的。分析表明,转录变化的PR蛋白编码基因的差异最显著。接种农杆菌GV3101后第6天与第3小时相比,有67个PR蛋白编码基因转录变化,其中60个下调,7个上调。而在60下降基因中,NB-LRR型抗病蛋白的编码基因有34个,对照中则只有5个。1.3接种农杆菌GV3101后第6天与第3小时相比,激素代谢相关基因的转录变化明显改变接种农杆菌GV3101后第6天与第3小时相比,激素代谢途径中有13个基因转录上调,60个基因的转录下调。而对照中有19个基因的转录上调,60个基因的转录下调。两种情形下,只有12个基因相同。接种农杆菌后激素代谢相关基因的转录变化明显不同。2.成熟期幼龄期相比,冠瘿瘤细胞的基因转录变化明显改变幼龄期冠瘿瘤细胞中有1223个基因转录发生变化,其中824个转录上升,393个转录下降。转录上升的基因比下降的2倍还多。在成熟期冠瘿瘤细胞中,则有3551个基因发生差异转录,其中1709个基因的转录上升,1842个转录下降。转录上升基因与下降基因相当。两个时期只有370个差异转录基因相同。2.1成熟期冠瘿瘤细胞中光合作用的差异基因转录受到抑制成熟冠瘿瘤细胞中有106个光合作用相关基因发生了差异转录,其中103个转录下降。而在幼龄期,只有6个光合作用相关基因转录发生变化,其中4个上升,2个下降。只有两个基因在两个时期都发生了转录变化。2.2幼龄期冠瘿瘤细胞中大部分呼吸代谢相关差异基因的转录增强,而成熟期的转录减弱幼龄期冠瘿瘤细胞的三羧酸循环相关基因中,5个差异转录基因全部上调;其线粒体电子传递链途径则有1]个发生差异转录,其中10个转录上调,1个转录下调。而在成熟冠瘿瘤细胞中,三羧酸循环相关基因中有10个基因的转录明显改变,其中7个增强,3个受到抑制;其线粒体电子传递链途径则有23个差异转录基因,其中15个基因的转录上调,8个转录下调。2.3幼龄期与成熟期冠瘿瘤细胞的核苷酸合成相关差异转录基因幼龄期冠瘿瘤细胞中14个核苷酸代谢相关基因的转录明显变化,其中12个转录增强,2个转录减弱。嘧啶核苷酸代谢途径中的5个差异基因全部上升;嘌呤核苷酸代谢9个差异转录基因中4个参与鸟嘌吟核苷酸的从头合成,转录全部增强,腺嘌呤核苷酸的从头和补救合成途径都没有基因差异转录。其余参与各种核苷酸的转换。成熟期冠瘿瘤细胞中,有35个核苷酸代谢相关基因的转录发生变化,18个转录增强,17个转录减弱。当中14个参与嘧啶核苷酸代谢,21个参与嘌呤核苷酸代谢。尿嘧啶核苷酸从头合成中有两个基因转录增强,没有转录下降基因。尿嘧啶核苷酸和腺嘌呤核苷酸的补救途径中各有1个差异基因,转录增强。次黄嘌呤合成途径中一个基因发生差异转录,其水平下降。其余的与核苷酸转换相关。2.4成熟期冠癭瘤细胞RNA的转录调控更加复杂幼龄期冠瘿瘤细胞中有110个RNA相关基因发生差异转录,其中72个转录增强,38个转录减弱,包括参与RNA加工的15个基因（转录全部增强）,参与RNA结合的4个基因（转录全部增强）,参与RNA合成的5个基因(4个增强,一个减弱,参与转录调控的86个基因（49个转录增强,37个转录减弱）。成熟期冠瘿瘤细胞中有326个RNA相关基因发生差异转录,其中186个基因转录增强,140个基因转录减弱。当中,参与RNA加工的24个基因（16个增强,8个减弱）,参与RNA结合的18个基因（5个上调,13个下调）,参与RNA合成的13个基因(7个增强,6个减弱,参与转录调控的271个基因（158个转录增强,113个转录减弱）。2.5成熟期冠瘿瘤细胞的蛋白质合成明显受到抑制幼龄期冠瘿瘤细胞中有267个蛋白相关基因发生差异转录,其中只有35个基因的转录减弱。而成熟期冠瘿瘤细胞中有565个发生差异转录,其中274个转录受到抑制。成熟期冠瘿瘤细胞中许多转录下降的基因与叶绿体相关。蛋白质合成的起始、延伸和肽链释放反应过程转录变化差异明显。幼龄期冠瘿瘤细胞中分别有16个（15个增强,1个减弱）、6个（全部增强）和0个基因发生差异转录,而成熟期细胞中分别有15个（5个增强,10减弱）、9个（4个增强,5个减弱）和5个基因（1个增强,4个减弱）转录变化。2.6成熟期冠瘿瘤细胞的脂类代谢相关基因变化显著幼龄期冠瘿瘤细胞中有29个脂类代谢相关基因的转录发生变化,当中11个转录增强,18个转录减弱。而成熟期中有65个发生了差异转录,其中23个水平上升,42个下降。8个差异基因相同。2.7成熟期冠癭瘤细胞的胁迫反应的基因转录完全改变在幼龄期冠瘿瘤细胞中,生物胁迫和非生物胁迫分别有20和30个基因的转录发生变化。而成熟期细胞中分别有54和52个。其中差异较大的是转录变化的PR蛋白编码基因。在幼龄期,只有3个PR蛋白编码基因转录变化,全部下调,而成熟期多达22个PR蛋白编码基因的转录发生变化,其中13个转录下降,9个转录上调。非生物胁迫相关基因中,光胁迫、干旱/盐胁迫、热胁迫基因的转录变化差异明显。幼龄期冠瘿瘤细胞中分别有0个、2个（转录都下调）和15个（10上调,5个下调）基因的转录变化,而成熟期分别有3个（转录都下调）、12个（5个上调,7个下调）和16个（6个下调,10个上调）。两个时期没有共有差异转录基因。2.8成熟期冠瘿瘤细胞的信号途径的基因转录受到一定程度的抑制幼龄期冠瘿瘤细胞中有59信号途径相关基因发生差异转录,当中40个转录增强,19个转录减弱。而成熟期有185个信号途径相关基因的转录发生改变,其中101个转录增强,84个转录减弱。G蛋白编码基因的转录变化差异明显。幼龄期冠瘿瘤细胞中有14个G蛋白编码基因发生差异转录,只有1个的转录是下降的,其它13个全部上升。而成熟期有30个G蛋白编码基因的转录发生变化,其中水平下调的多达14个基因,表明某些信号途径受到一定程度的抑制。3.VirD2和VirE2蛋白的表达本研究从农杆菌C58和LBA4404基因组中分别克隆了 vird2和vire2基因,并构建了克隆载体pCVD2和pCVE2。通过亚克隆分别构建了表达载体pEVD2和pEVE2,并表达和纯化了 VirD2和VirE2融合蛋白,对VirD2体外单独切割ssT-DNA和质粒T-DNA做了尝试。