第一部分:sa RNA(ds VEGF-706)上调绒毛外滋养细胞VEGF的表达。【目的】本部分主要目标是对人绒毛外滋养细胞(HTR-8/Svneo)转染荧光标记的sa RNA(ds VEGF-706),通过流式及荧光拍照来检测转染效率,再分别从m RNA和蛋白质水平检测滋养细胞内VEGF是否上调,验证转染效果是否符合预期设想。【方法】1.实验分为mock组、cotrol组、ds VEGF-706组分别转染完成后72小时进行荧光拍照,同时于转染后72小时应用流式细胞仪检测各组的转染效率。2.采用RT-PCR的方法于转染后72小时检测各分组VEGFm RNA表达的变化。3.应用western-blot的方法,于转染完成后72小时检测各分组VEGF蛋白的表达情况。【结果】1.荧光拍照显示,与control组及mock组相比,ds VEGF-706组有明显的的荧光信号即提示有较高的转染效率,流式结果显示ds VEGF-706组转染效率达94.83%。2与control组相比,ds VEGF-706组VEGF m RNA的表达明显增高,差异具有显著性(P=0.003)3.与congtrol组相比,ds VEGF-706组VEGF蛋白的表达明显升高,差异具有显著性(P=0.012)【结论】小激活RNA(ds VEGF-706)能够明显上调人绒毛外滋养细胞(HTR-8/Svneo)内VEGF的表达,与预期的实验结果相符,这将有望将小激活RNA(ds VEGF-706)应用于子痫前期的治疗。第二部分:sa RNA(ds VEGF-706)上调VEGF表达对正常滋养细胞及子痫前期滋养细胞模型迁移能力、成管能力及e NOS-NO信号通路的影响。【目的】探讨内源性上调人绒毛外滋养细胞(HTR-8/Svneo)VEGF的表达对人绒毛外滋养细胞及子痫前期滋养细胞模型迁移能力、血管生成能力及e NOS-NO信号通路的影响。【方法】1.运用细胞划痕实验,检测ds VEGF-706对滋养细胞迁移能力的影响。2.在不同分组处理滋养细胞的的情况下,利用基质胶3D培养技术观察各组滋养细胞成管能力的变化。3.采用硝酸盐还原法检测不同分组NO的表达,应用western-blot的方法检测各组e NOS的表达,阐明ds VEGF-706增强滋养细胞迁移能力和成管能力的可能机制。【结果】1.与control组相比,ds VEGF-706转染后,滋养细胞的迁移能力明显增强,差异具有显著性(P=0.024)。2.与control组相比,ds VEGF-706转染能明显增加滋养细胞的成管能力,差异具有显著性(P=0.013)。与control组相比,在TNF-a处理过的HTR-8/Svneo(即是TNF-a组)的血管生成能力明显下降,差异具有统计学意义(P=0.001)。但是,与TNF-a组相比,在TNF-a处理转染过ds VEGF-706的滋养细胞时(即是TNF-a+ds VEGF-706组),滋养细胞血管生成能力明显增强,差异有统计学意义(P=0.014)。3.NO合成能力检测显示:与control组相比,ds VEGF-706转染后72h,滋养细胞NO的合成能力明显增强,差异有统计学意义(P=0.0003)。与control组相比,TNF-a处理组,滋养细胞NO合成能力下降了51%,差异有统计学意义(P=0.001)。但与TNF-a组相比,TNF-a+ds VEGF-706组滋养细胞NO合成能力明显改善。e NOS蛋白水平检测显示:与control组相比,ds VEGF-706转染后72h,滋养细胞e NOS的表达明显上调,差异有统计学意义(P=0.032)。与control组相比,TNF-a处理组,滋养细胞e NOS蛋白表达明显下降,差异有统计学意义(P=0.004)。但与TNF-a组相比,TNF-a+ds VEGF-706组滋养细胞e NOS的表达水明显得到改善。【结论】1.sa RNA(ds VEGF-706)上调滋养细胞内VEGF后能明显增强滋养细胞的迁移能力及成管能力,而TNF-a能明显抑制滋养细胞的成管能力,但用TNF-a处理ds VEGF-706转染过的滋养细胞,滋养细胞的成管能力明显得到改善。这表明滋养细胞内上调的VEGF能有效对抗TNF-a对滋养细胞成管能力的抑制作用。2.sa RNA(ds VEGF-706)上调滋养细胞内VEGF后能明显增强滋养细胞NO合成能力及e NOS蛋白的表达水平,相反,TNF-a处理滋养细胞后,其NO合成能力及e NOS蛋白的表达水平明显受到抑制,但用TNF-a处理ds VEGF-706转染过的滋养细胞,其NO合成能力及e NOS蛋白的表达水平明显得到改善。这表明ds VEGF-706不仅上调了VEGF表达,还激活e NOS-NO通路,进而增强滋养细胞的迁移能力和血管生成能力,从而有望成为子痫前期的治疗途径。