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黑素瘤的增殖与侵袭是其恶性生物学行为的主要特征，也是黑素瘤难治愈，预后差、易复发的主要因素。对黑素瘤侵袭与转移分子机制研究，特别是分子阻断和基因治疗的研究是治愈黑素瘤的希望所在。信号传导系统通过很复杂的网络传导细胞间的相互作用，是基因与外界联系的通道。恶性黑素瘤的发生发展伴随着多种信号通路的异常，其中Wnt信号通路在黑素瘤的恶性生物学行为中发挥重要作用成为当前黑素瘤研究的热点。Wnt信号通路重要配体Wnt5a参与调控黑素瘤的侵袭与转移。胞内受体钙调神经磷酸酶（calcineurin, CaN）是唯一受Ca2+和钙调素（calmodulin CaM）调控的保守的Ser/Thr蛋白磷酸酶，可使活化T细胞核因子（Nuclear factor of activatedT cells，NFAT）去磷酸化，促使NFAT转位至细胞核，作用于下游靶分子血管内皮生长因子（VEGF）、原癌基因c-myc、环氧合酶2（COX-2），调控黑素瘤的生物学行为。Calcineurin//NFAT信号通路异常与黑素瘤的增殖、侵袭密切相关。探明Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT信号通路在黑素瘤生物学性能中的作用对分子靶向治疗黑素瘤将具有重要的科研与临床意义。本课题组首先利用RT-PCR及Western blot检测了恶性黑素瘤中Wnt/Ca2+信号通路中重要信号分子的表达情况，用免疫荧光检测细胞内Ca2+变化，证实在黑素瘤中Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT通路处于激活状态。探讨Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT通路在黑素瘤细胞生物学中的作用是本课题重点研究的内容，我们利用新型慢病毒包装系统构建wnt5a的过表达载体和siRNA表达载体，检测该通路中重要信号分子的表达变化及慢病毒稳转黑素瘤细胞的增殖、侵袭能力变化。证实Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT通路可能在黑素瘤细胞增殖、侵袭中发挥重要作用，为黑素瘤的分子靶向治疗提供新靶点和新方向。实验一过表达和抑表达wnt5a稳转黑素瘤细胞株的建立根据人wnt5a基因mRNA序列设计针对Wnt5a CDS序列的PCR引物和wnt5asiRNA。选择黑素瘤细胞株WM793B（wnt5a+++）提取细胞总RNA，进行RT-PCR，获得wnt5a cDNA，克隆入穿梭质粒载体pENTR3C中，获得重组质粒pENTR3C-wnt5a。将重组质粒pENTR3C-wnt5a与骨架质粒pLenti6.3/V5-DEST进行同源重组反应，获得重组质粒pLenti6.3-wnt5a。利用慢病毒包装系统和HEK293T细胞包装出含有pLenti6.3-wnt5a的慢病毒颗粒，感染黑素瘤细胞A2058(wnt5a-)，建立稳定过表达wnt5a稳转黑素瘤细胞系A2058-pLenti6.3-Wnt5a。构建下调wnt5a基因的重组质粒pLKO.1-shwnt5a，利用慢病毒包装系统和HEK293T细胞包装、制备携带shwnt5a的重组慢病毒颗粒，感染WM793B黑素瘤细胞(wnt5a+++)，建立稳定低表达wnt5a稳转黑素瘤细胞系WM793B-pLKO.1-shwnt5a。对经过筛选、单克隆培养的稳转黑素瘤细胞中Wnt5a蛋白表达情况进行Western-Blot检测：A2058-pLenti6.3-Wnt5a细胞中Wnt5a高效过表达；WM793B-pLKO.1-shwnt5a细胞中Wnt5a被有效的抑制。证实获得了稳定过表达和抑表达Wnt5a的稳转黑素瘤细胞系，为研究Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT通路对黑素瘤细胞生物学的影响提供实验模型。实验二调控Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT通路对黑素瘤细胞增殖、侵袭能力的影响采用Western blot技术检测过表达和低表达Wnt5a的稳转细胞中Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT通路中重要的信号分子VEGF、CAN、NFAT的表达情况，实验结果显示：Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT通路中信号分子VEGF、CAN、NFAT的表达在Wnt5a表达升高会出现不同程度的升高，在Wnt5a表达被抑制时出现不同程度的降低。对建立的过表达和抑表达wnt5a的稳转黑素瘤细胞进行生物学性能检测：利用MTT法检测细胞增殖能力；利用Transwell小室实验检测细胞侵袭能力；利用流式细胞术检测细胞周期。对实验结果分析对比示：过表达wnt5a组较空白对照组增殖、侵袭能力增强；抑表达wnt5a组较空白对照组增殖、侵袭能力减弱，同时用相同的方法检测环孢素A处理过的过表达wnt5a稳转黑素瘤细胞的侵袭、增殖能力和细胞周期的变化。实验结果表明环孢素A处理后的黑素瘤细胞的S期降低，增殖、侵袭能力减弱。结论：1.成功建立过表达和抑表达wnt5a慢病毒稳转黑素瘤细胞系，为进一步研究Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT通路在黑素瘤细胞生物学中的作用提供了模型和平台。2.过表达Wnt5a可致黑素瘤细胞的增殖、侵袭能力升高；抑制Wnt5a表达可使黑素瘤细胞增殖、侵袭能力的减弱。3. Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT通路中重要的信号分子VEGF、CAN、NFAT在Wnt5a表达升高时会出现不同程度的表达升高；在抑制Wnt5a表达后，VEGF、CAN、NFAT表达出现不同程度的降低。4.环孢素A作用后的过表达Wnt5a稳转黑素瘤细胞侵袭与增殖能力减弱。