本课题选用HMME做光敏剂，532nm激光为光源，研究不同不同光敏剂剂量及不同激光照射剂量的光动力学作用对兔血管平滑肌细胞的影响，用MTT法、台盼蓝法检测及形态学观察研究HMME-PDT对VSMC细胞的杀伤作用，用流式细胞仪等观察细胞凋亡的情况，用流式细胞仪和共聚焦显微镜等方法观察活性氧物质的产生、HMME在细胞内的分布以及细胞骨架的变化来探讨HMME-PDT诱导凋亡的可能机制。为临床提出一种预防血管成形术后血管再狭窄新方法并设计开发相应的专用激光治疗设备提供依据。 材料与方法： 1 材料 1.1试剂 光敏剂HMME由上海第二医科大学药物研究所提供，工作液浓度为10μ g/ml，由不含血清的RPMI 1640新鲜配制。Annexin V/PI双染试剂盒购自罗氏公司。Rohdamine 123，DCFH-DA，Hoechst33342和FITC-phalloidin购自Molecular Probes公司。台盼兰和MTT购自SIGMA公司。RPMll640培养基购自SIGMA公司。胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，经热原处理。 1.2仪器 光源为光纤耦合半导体激光器，由武汉凌云光电科技有限责任公司生产，输出激光波长532nm。激光功率计为加拿大Gentec公司产品。激光共聚焦扫描显微镜为德国ZEISS公司产品。流式细胞仪为美国Beckman coulter公司产品。 2方法 2.1 细胞培养 兔经静脉注射空气处死，开胸取胸至腹段主动脉约12cm，沿血管纵轴剪开，刮除内膜，取动脉中层剪成碎块后贴于细胞培养瓶底，加入含10﹪胎牛血清的RPMI1640培养液，置于37℃、5﹪CO<,2>孵箱内孵育，5天后换液，待10～12天后组织块周围形成"细胞晕"时传代。 2.2光动力作用 在处于对数生长期的细胞中加入10μg/ml HMME孵育2h，倒弃培养液，PBS清洗后加入新鲜含10﹪血清的RPMI 1640培养液，即刻进行照光。激光功率密度为10mW/cm<2>。 2.3检测HMME-PDT对细胞增殖的抑制 体外培养的兔血管平滑肌细胞，以每孔1×10<5>个细胞均匀接种于24孔培养板内，每孔1ml，贴壁24h，之后用不含血清的培养液培养24h，使细胞周期同步化。然后加入不同终浓度的光敏剂在37℃避光孵育2h，再用PBS洗3次，加入完全培养基，即刻进行激光照射。照光后将培养板放置在培养箱继续避光培养6h或24h，MTT法和台盼蓝排除法检测各组细胞吸光度，计算各组细胞存活率或抑制率。 2.4.形态学观察 体外培养的血管平滑肌细胞，以每孔5×10<5>个细胞均匀接种于内置小玻片的24孔培养板中，贴壁24h。PDT组加入10μg/ml的光敏剂HMME，激光照射能量密度为2.4J/cm<2>。空白对照组未加任何处理。光动力学作用后，再培养24h，分别进行HE染色光镜观察、Hoechst 33342染色荧光显微镜观察，拍照。 2.5流式细胞仪检测细胞凋亡 体外培养的VSMC细胞均匀接种6孔培养板中，贴壁24h。PDT组加入10μg/ml光敏剂HMME，激光照射能量密度为2.4J/cm<2>。空白对照组未加任何处理。光动力学作用后，再培养24h，收集各组细胞，Annexin V/PI双染，流式细胞仪检测细胞的凋亡率和坏死率。 2.6激光共聚焦显微镜观察HMME在细胞内的亚定位将 细胞接种于专用的35mm Petri培养皿。细胞贴壁后，分别用HMME和线粒体荧光探针Rhodamine 123进行孵育，然后用PBS缓冲液冲洗3次，加入1ml PBS维持细胞的生理状态。置于共聚焦显微镜下进行观察。 2.7流式细胞仪检测ROS的产生 体外培养的VSMC细胞均匀接种6孔培养板中，贴壁24h。PDT组加入10.μg/ml光敏剂HMME，激光照射能量密度为2.4J/cm<2>。空白对照组未加任何处理。光动力学作用后，选取0～4h内不同时间点，收集各组细胞，DCFH-DA染色，流式细胞仪检测细胞内ROS的含量。 2.8观察PDT处理后细胞骨架的变化 <1>考马斯亮蓝染色法体外培养的血管平滑肌细胞，以每孔5×10<5>个细胞均匀接种于内置小玻片的24孔培养板中，贴壁24h。PDT组加入10μg/ml的光敏剂HMME，激光照射能量密度分别为1.2 J/cm<2>、2.4.J/cm<2>、4.8 J/cm<2>。空白对照组未加任何处理。光动力学作用后，再培养24h，常规考马斯亮蓝染色，光镜下观察，拍照。 <2>FITC-phalloidin荧光染色法将细胞接种于专用的35mm Petri培养皿，贴壁24h。PDT组加入10μg/ml的光敏剂HMME，激光照射能量密度为2.4J/cm<2>。空白对照组未加任何处理。光动力学作用后，再培养30min、2h和24h，固定，抽提，封闭、FITC-phalloidin和Hoechst33342染色，激光共聚焦显微镜下观察。 2.9统计学分析 所有数据均以均数±标准差表示，SPSS 13.0软件包分析样本，采用单因素方差分析法进行分析，p<0.05表示有统计学意义。 结果： 1.单纯激光照射组和单纯光敏剂组的细胞存活率和空白对照组比较，无统计学差异，即单纯激光照射和单纯光敏剂孵育对VSMC细胞增殖无明显的抑制作用。各PDT组细胞存活率和空白对照组比较，有统计学差异，即PDT对VSMC细胞的增殖有明显的抑制作用。PDT对VSMC细胞增殖的抑制与光敏剂浓度和激光照射剂量在一定范围内呈正比关系。即随着光敏剂浓度的增加和激光剂量的加大，细胞的抑制率随之增加。细胞半数致死剂量为HMME浓度10μg/ml及激光能量密度2.4J/cm<2>.HE染色和荧光显微镜结果也显示HMME-PDT作用细胞后细胞形态发生明显的变化，细胞呈凋亡或坏死样改变。 2.流式细胞仪检测结果显示，HMME-PDT可诱导VSMC细胞发生凋亡和坏死，其凋亡率达到50.5﹪。 3.通过激光共聚焦显微镜的检测，观察到HMME的荧光与线粒体的荧光有重叠。显示HMME在线粒体内有分布。 4.ROS检测结果显示PDT作用后不同时间段细胞内ROS的产生可分为两个阶段：第一个上升期是在PDT后30min，1h后开始下降；第二个上升期是PDT后2h。即PDT后确有ROS的升高，且其升高呈现双峰。 5.考马斯亮蓝染色法结果显示正常组细胞的细胞正常细胞的细胞骨架分布均匀有致，肌丝清晰可见，在膜周和核周浓集。而PDT组细胞随着剂量的增大，依次出现了肌丝排列紊乱、收缩、断裂等现象，并在核周浓集，有部分形成了凋亡小体。共聚焦显微镜观察结果显示PDT后30min荧光图象变暗，肌丝模糊，而在2h时，绿色荧光重新变亮，围绕核呈环状排列，并且核开始固缩，这说明肌动蛋白发生了解聚和重排。PDT后24h细胞出现明显的凋亡状态。 结论： 1.用不同浓度的光敏剂HMME(5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)以及不同能量密度的532nm激光(0.3 J/cm<2>、0.6 J/cm<2>、1.2 J/cm<2>、2.4 J/cm<2>、4.8 J/cm<2>)对兔血管平滑肌细胞进行光动力学处理，均可对细胞的增殖产生明显的抑制作用，并在一定的剂量范围内呈明显的剂量依赖性。单纯光敏剂或单纯激光照射对细胞的增殖无抑制作用。 2.波长为532nm的半导体激光联合HMME的光动力学作用可诱导兔血管平滑肌细胞的凋亡。 3.光敏剂HMME在兔血管平滑肌细胞内可定位于线粒体。 4.血卟啉单甲醚光动力学疗法作用于兔血管平滑肌细胞VSMC后，产生了大量的ROS，并引起细胞骨架在PDT后不同时间和不同剂量下发生相应的变化。