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MicroRNA (miRNA)是一大类内源性非编码小RNA,通过转录后翻译抑制或靶mRNA裂解参与细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程。人类基因组中已鉴定出超过1000个miRNA,均为组织特异性表达。每个miRNA可以有多个靶基因,其本身的表达又受到不同机制调控,其中包括:转录因子结合、表观改变和染色体异常等。研究发现,miRNA与细胞的癌变有着极为密切的关系。最近的研究表明,miRNA在胃肠道恶性肿瘤中扮演致癌或抑癌基因的角色。对于miRNA表达调控的研究将是针对人类胃肠道恶性肿瘤化学性预防的一种新策略。为深入阐释miRNA在胃癌发生过程中发挥的重要作用,揭示相关miRNA在胃粘膜细胞癌变中受到的转录调控和对基因表达的调控机制,我们利用miRNA阻遏物文库首次在胃癌细胞中以增殖表型为模型,进行了基于微电子传感器阻抗变化的胃癌增殖相关miRNA的高通量功能缺失性筛选,发现了12个能明显抑制胃癌细胞增殖的anti-miRNA分子;其中miR-483-3p的抑癌作用最为显著。我们对紧密联锁于11号染色体的miR-483-3p和miR-675进行了深入研究。分析发现,miR-483-3p位于宿主基因胰岛素样生长因子受体(IGF)2的第7个内含子中,miR-675位于宿主H19的第一个外显子中,提示miR-483-3p和miR-675可能均与各自的宿主基因共转录。IGF2和H19是最早发现的印迹基因,二者紧邻于11号染色体上,均具有促进多种肿瘤细胞增殖的重要生物学功能。截至目前,尚未见miR-483-3p参与肿瘤发生发展的相关报道。那么,miR-483-3p和miR-675的上游转录调控机制是什么?二者是否参与了IGF2/H19相关促胃癌信号的调控新机制?本课题将对此进行探讨。【目的】1、高通量功能缺失性筛选胃癌细胞增殖相关miRNA;2、研究miR-483-3p和miR-675参与胃癌细胞增殖的作用;3、探讨miR-483-3p和miR-675的上游共转录机制和下游调控通路;4、明确miR-483-3p和miR-675的靶基因在胃癌中的表达和作用机制;5、探讨miR-145对miR-483-3p和miR-675的调控作用。【方法】1、利用miRNA阻遏物文库(miRNA inhibitor library)和基于微电子传感器阻抗变化的实时细胞高通量筛选仪,功能缺失性筛选胃癌细胞增殖相关的miRNA分子;2、构建miR-483-3p和miR-675慢病毒载体;3、用体外细胞增殖实验、平板克隆形成实验、软琼脂集落形成实验和裸鼠体内荷瘤实验等研究miR-483-3p和miR-675对胃癌细胞体内外成瘤能力的影响;用流式细胞仪检测miR-483-3p和miR-675对细胞周期的影响,用激光共聚焦Edu细胞增殖实验检测miR-483-3p和miR-675对细胞DNA复制的影响;4、通过ChIP、EMSA等方法验证c-Myc对miR-483-3p和miR-675的转录调控;5、通过全基因组表达谱芯片和生物信息学联合预测的方法筛选miR-483-3p和miR-675的靶基因;6、构建双荧光素酶报告基因载体,用双荧光素酶报告基因实验、Real time RT-PCR和Western Blot等方法验证miR-145对c-Myc的负调控及miR-483-3p和miR-675的靶基因;7、利用免疫组织化学染色、MTT实验等研究miR-483-3p和miR-675的靶基因在胃癌中的表达及与胃癌细胞增殖的关系。【结果】1、miR-483-3p和miR-675能明显促进胃癌细胞增殖。我们利用miRNA阻遏物文库进行了基于微电子传感器阻抗变化的实时细胞高通量功能缺失性筛选,以胃癌细胞系SGC7901的增殖表型为基础,筛选到了12个明显抑制胃癌细胞增殖的anti-miRNA分子。其中,anti-miR-483-3p的抑癌作用最为显著。分析发现,miR-483-3p和miR-675是紧邻于11号染色体上的两个miRNA分子。我们对miR-483-3p和miR-675参与胃癌细胞增殖的作用进行了深入研究。实时荧光定量PCR检测结果表明miR-483-3p和miR-675在胃癌细胞系SGC7901、AGS和MKN45中的表达水平显著高于正常胃粘膜永生化细胞系GES-1;在12例新鲜胃癌组织中,二者在其中8例中的表达水平显著高于相应的癌旁组织。通过构建miR-483-3p和miR-675的慢病毒载体,稳定转染SGC7901和MKN45细胞进行体内外功能实验,结果发现,上调miR-483-3p和miR-675的表达可以明显促进胃癌细胞的体外平板克隆、软琼脂集落形成能力和裸鼠体内荷瘤能力;分别瞬时转染miR-483-3p和miR-675的inhibitors则显著抑制胃癌细胞的体内外成瘤能力。流式细胞周期检测结果发现miR-483-3p和miR-675可以促进胃癌细胞G1期进展,激光共聚焦结果表明二者均可以明显促进胃癌细胞DNA复制。上述结果提示,miR-483-3p和miR-675有促进胃癌细胞增殖的作用。2、miR-483-3p和miR-675分别以IGF2BP1、BRCA2和PITX1为靶基因参与促胃癌信号通路的调控。我们进一步用基因表达谱芯片结合靶基因联合预测的方式筛选了miR-483-3p和miR-675的靶基因。在SGC7901中瞬时转染miR-483-3p后行全基因组表达谱芯片检测,发现1812个基因被下调;用TargetScan和miRanda联合预测到miR-483-3p的靶基因有402个;上述结果的交集有13个基因,其中唯一的抑癌基因为乳腺癌易感基因(BRCA)2,下调了2.17倍。同样,在SGC7901中瞬时转染miR-675后行全基因组表达谱芯片,490个基因被下调;用TargetScan和miRanda联合预测到miR-675的靶基因有208个;上述结果的交集有25个基因,其中唯一的抑癌基因是垂体后叶素同源异型盒(PITX)1,下调了2.54倍。实时荧光定量PCR和Western blot方法证实miR-483-3p可以下调BRCA2的mRNA和蛋白水平,miR-675则能下调PITX1的mRNA和蛋白水平;相反,miR-483-3p和miR-675的inhibitors则能分别上调BRCA2和PITX1的mRNA和蛋白水平。双荧光素酶报告基因实验证实miR-483-3p和miR-675可以分别直接结合BRCA2和PITX1的3‘UTR。此外,TargetScan、miRanda和Pictar联合预测发现,IGF2的翻译抑制因子胰岛素样生长因子结合蛋白(IGF2BP)1是miR-483-3p的潜在靶基因;实时荧光定量PCR和Western blot方法证实miR-483-3p可以下调IGF2BP1的蛋白水平,但并不影响其mRNA水平。双荧光素酶报告基因实验证实miR-483-3p可以分别直接结合IGF2BP1的3‘UTR。3、IGF2BP1、BRCA2和PITX1在胃癌中发挥抑癌作用。为了进一步明确miR-483-3p和miR-675的靶基因在胃癌中发挥抑癌作用,我们进行了深入的研究。RT-PCR和Western blot结果表明IGF2BP1、BRCA2和PITX1在胃癌细胞SGC7901和MKN45中的表达显著低于正常胃粘膜永生化细胞GES-1。免疫组化结果发现,IGF2BP1、BRCA2和PITX1在76例胃癌组织中的表达显著低于癌旁组织,胃癌组织分化程度越低,其表达水平越低(p<0.01)。利用它们的特异性siRNA分别转染GES-1细胞均可显著促进细胞增殖,并能促进细胞周期进展(p<0.05)。4、miR-483-3p和miR-675共同受c-Myc的直接转录调控。有研究证实,IGF2和H19均可受c-Myc转录激活,而IGF2和H19分别是miR-483-3p和miR-675的宿主基因;提示miR-483-3p和miR-675很可能也同时受到了c-Myc直接转录调控。我们结合转录因子数据库利用转录因子预测软件同样发现c-Myc是miR-483-3p和miR-675的潜在上游转录因子。染色质免疫沉淀实验(ChIP)和凝胶电泳迁移滞后实验(EMSA)进一步证实,c-Myc可以分别直接结合miR-483-3p和miR-675上游启动子区的第8个和第4个转录结合位点;增加SGC7901和MKN45中c-Myc的表达可以明显上调miR-483-3p和miR-675的表达水平,而抑制SGC7901和MKN45中c-Myc的表达则明显下调miR-483-3p和miR-675的表达水平。5、miR-145通过负调控c-Myc间接调控miR-483-3p和miR-675。有研究证实,p53激活的miR-145能以c-Myc为靶基因对其负调控;而我们发现c-Myc可以直接转录激活miR-483-3p和miR-675,由此推测,miR-145可能通过c-Myc负调控miR-483-3p和miR-675的表达。我们发现,miR-145可以通过G1期阻滞抑制胃癌细胞SGC7901的体外平板克隆形成能力;实时荧光定量PCR和Western blot方法证实,在胃癌中miR-145可以下调c-Myc蛋白水平,而miR-145的inhibitors则能上调c-Myc蛋白水平。双荧光素酶报告基因实验证实miR-145可以直接结合c-Myc的3‘UTR。深入研究发现,在胃癌组织中miR-145分别与miR-483-3p和miR-675的表达水平均呈负相关;在SGC7901和MKN45中转染miR-145的mimic可以显著下调miR-483-3p和miR-675的表达水平;而在GES-1中转染miR-145的inhibitor则明显上调miR-483-3p和miR-675的表达水平;若用miR-145的inhibitor和c-Myc的特异小分子抑制剂10058F4共同处理GES-1细胞,miR-145对miR-483-3p和miR-675的表达水平上调的作用被逆转。6、miR483-3p/miR675-miR145正反馈环路参与c-Myc介导的促胃癌发生作用。BRCA2和PITX1分别是miR-483-3p和miR-675的靶基因,有研究证实,BRCA2可以和p53协同发挥抑癌作用,PITX1则能直接转录激活p53发挥抑癌功能,而p53可以直接转录激活miR-145。我们发现,下调PITX1的表达可以显著抑制p53的蛋白水平,同时能抑制miR-145的表达水平;下调BRCA2的表达同样可以显著抑制miR-145的表达水平。由此在胃癌发生过程中形成了一个由miR483-3p/miR675-miR145正反馈环路介导的c-Myc促胃癌发生的调控新机制。【结论】miR-483-3p和miR-675是新的促胃癌增殖相关miRNA,其上游受c-Myc直接转录调控,下游分别负调控IGF2BP1、BRCA2和PITX1,随后以p53依赖或非依赖方式调控miR-145;miR-145又通过负调控c-Myc间接调控miR-483-3p和miR-675;由此胃癌发生过程中形成了一个由miR483-3p/miR675-miR145正反馈环路介导的c-Myc促胃癌发生的调控新机制。