论文部分内容阅读
水稻包穗是指进入幼穗分化末期后,水稻幼穗被包在叶鞘内而无法抽出的现象。本研究以籼稻包穗突变体M893及其野生型T893为材料,通过水稻基因组重测序和分析比对鉴定到包含突变位点的基因shpx(sheathed panicle gene X),并进行了shpx生物信息学和基因表达分析、构建了shpx的过表达载体、亚细胞定位载体及CRISPR/Cas9基因编辑载体,以及转化水稻等方面的研究,主要结果如下:1、通过对野生型T893与突变体M893基因组重测序结果比对分析,发现突变位点位于2号染色体的5799448位点上,该位点的碱基由G/C突变为T/A,在突变位点所在区域的侧翼序列设计特异性引物进行PCR扩增和测序验证,发现该位点存在突变,证实了重测序结果的正确性,将该位点所在基因命名为shpx。2、通过分析shpx基因结构特点,发现突变位点恰好位于第二内含子与第三外显子的剪切处。通过分析shpx基因的转录表达产物发现,相对于野生型,shpx在突变体中不能表达出完整转录产物,表明因为突变影响基因的剪接,由此推测shpx基因转录产物的结构改变导致M893突变体的包穗表型。3、通过生物信息学分析,shpx基因属于“C2H2”型锌指蛋白基因,由4个外显子和3个内含子构成,DNA全长7616 bp,编码173个氨基酸,其编码蛋白含有3个锌指结构域。SHPX蛋白同源序列比对分析发现其在多种生物中保守存在,且玉米、高粱、短柄草等中具有较高的同源性。4、通过水稻生物芯片分析发现shpx在穗中表达最高,茎、叶中表达其次,在根中表达较低,但是荧光定量PCR的结果却显示shpx在生育期5期的水稻叶片中的表达最高,在茎和根中表达其次,穗中表达最低。5、通过构建SHPX融合GFP的亚细胞定位载体pCAMBIA2300-SHPX-GFP和转化水稻原生质体瞬时表达分析,并通过激光共聚焦显微镜下观察,发现SHPX蛋白定位于细胞核内。6、通过构建shpx过表达载体pUbi130-shpx及CRISPR/Cas9基因编辑载体pYLCRISPR/Cas9-shpx,转化水稻愈伤获得转基因植株,并通过扩增潮霉素标记基因筛选,分别获得了相应转化体的阳性转基因水稻幼苗。这些结果为研究水稻锌指蛋白shpx基因的功能和调控水稻包穗的分子机制提供了重要的理论基础。此外,本研究开展了锌指蛋白OsBBX24-RNAi的转基因水稻苗期响应热胁迫方面的研究,发现了OsBBX24-RNAi株系耐热性弱于野生型Kitaake,表明OsBBX24基因赋予水稻一定的耐热性。