随着干细胞技术的不断发展,能够用于人类再生医学的具有克服免疫排斥反应的治疗性胚胎干细胞逐渐成为人们研究的热点。通过体细胞核移植技术获得的胚胎干细胞,因为具有与体细胞提供者相同的基因型被认为是克服免疫排斥反应的最佳途径,然而,取于患病动物的体细胞是一种隐含有突变基因的分化细胞,不但克隆囊胚生成率很低,而且因含有突变基因,通过体细胞克隆途径所获得的胚胎干细胞的质量也会存在问题。与此相比,孤雌胚胎干细胞则因为是来源于具端粒酶活性且尚未经历个体分化途经的生殖细胞,理伦上这种来源于生殖细胞的干细胞不存在当代受治疗动物的突变基因,因此,这种孤雌胚胎干细胞（pES）系的医学应用前景更广阔,意义重大。同样,来源于哺乳动物MⅡ期卵母细胞孤雌激活胚胎与克隆胚胎相比,具有与提供卵母细胞母体相同的组织相容性复合物,由此获得的干细胞也能够像体细胞克隆胚胎干细胞一样克服免疫排斥反应。但是,来源于MⅡ期卵母细胞孤雌激活胚胎则因为缺乏父源基因印迹作用,其发育潜能受到限制,从而导致其分离获得干细胞的分化潜能也有可能因此而受到限制;由于雄性基因组在胚胎发育中是必须的,那么,利用MⅡ期卵母细胞获得的孤雌胚胎与经性别鉴定的雄性胚胎进行嵌合发育,可以在一定程度辅助孤雌胚胎发育,并且可以用性别鉴定的方法鉴定得到的囊胚内细胞团是否来源于孤雌胚胎。本实验选择昆白小鼠为研究对象,针对孤雌胚胎干细胞获取新途径中,有性生殖胚胎与无性生殖孤雌胚胎嵌合发育有可能在早期胚胎细胞间通过旁分泌与白分泌因素促进孤雌胚发育的道理,本研究通过性别鉴定的方法选择雄性有性生殖胚胎与无性生殖MⅡ期卵母细胞孤雌激活胚胎嵌合发育,并通过性别鉴定的方法将这种由嵌合发育囊胚分离得到的细胞集落进行来源标记,旨在通过应用成熟的分子生物学性别鉴定方法,建立一种新的有性生殖雄性胚胎辅助提高与其嵌合的无性生殖孤雌胚胎发育生成囊胚的比率,并进一步通过这种性别鉴定方法,为分离鉴定由此囊胚获取孤雌胚胎干细胞的性别标识新模式奠定基础。试验结果如下:1小鼠孤雌胚胎与雄性胚胎嵌合发育影响因素研究本研究取小鼠MⅡ期卵母细胞进行孤雌激活,体外培养至8-细胞期,与经性别鉴定后获得的8-细胞期雄性胚胎嵌合培养,其目的是为了建立一种新的异性胚胎嵌合培养模式,在便于通过分子生物学方法对胚胎不同来源进行性别鉴定的基础上,研究两种不同类型胚胎细胞之间在嵌合发育过程中的相互影响,为从嵌合发育胚胎中分析标记来源于孤雌胚胎的干细胞研究过程奠定基础。本研究在初步建立孤雌激活胚胎与雄性胚胎嵌合发育程序的基础上,对于影响这种嵌合胚胎发育效果的几个主要因素做了进一步的研究。1.1获取小鼠二倍体孤雌胚胎的孤雌激活方法研究已知哺乳动物孤雌胚胎有几种染色体核型,孤雌胚胎不同倍性染色体核型的形成与卵母细胞孤雌激活的方式有关,其中杂合二倍体是一种在染色体质量上类似于有性生殖胚胎体细胞核型的无性生殖孤雌胚胎,为了获取这种胚胎,本研究通过两种化学方法激活昆白小鼠成熟卵母细胞,并抑制其第二极体排出,在显微操作仪下观察激活卵是否形成两原核,若形成则确定为杂合二倍体,本实验旨在选择生成杂合二倍体孤雌胚胎效率最佳的孤雌激活方法用于制作与雄性胚胎嵌合发育的8细胞期孤雌胚胎。结果显示:采用含10mmol/L的Srcl₂和5ug/mlCB处理4小时,激活率最高为76.7%,激活小鼠卵母细胞后形成杂合二倍体孤雌胚比例最高为39.5%,与乙醇联合6-DMAP激活后形成杂合二倍体孤雌胚比例31.6%略高,但差异不显著（p＞0.05）。1.2小鼠孤雌胚胎早期发育的培养体系研究小鼠卵母细胞孤雌激活之后,选取杂合二倍体胚胎,通过在不同培养液中的培养,对培养得到的2、4细胞和囊胚进行统计,旨在建立一套完善的适合杂合二倍体孤雌胚胎体外培养的体系,试验结果如下:（1）CZB和mM16能较好地过2-cell阻滞发育至囊胚,各组中2-cell胚胎发育率相近,差异不显著,但CZB+FBS和CZB+BSA组的4-cell胚胎发育率均较相应的mM16组高,胚胎发育速度较快;无论CZB或mM16培养液,添加FBS组的囊胚发育率均高于相应添加BSA的组,而且CZB添加FBS组的囊胚发育率高于其他各组,差异显著（p＜0.05）。（2）用CZB添加FBS组培养过2-cell阻滞,于培养到4-cell期后添加葡萄糖组的囊胚发育率稍好于未添加组,两组的囊胚发育率都明显高于全程添加组,且差异显著（p＜0.05）,。结果表明:在体外培养孤雌胚胎时,4-cell期之前采用CZB+15%FBS作为培养液,而当胚胎发育至4细胞时就换用CZB+15%FBS+1.1mg╱mLGlu培养。1.3用于性别鉴定的小鼠8-细胞期有性生殖胚胎最佳获取时间研究为了获得较多的8细胞胚胎,在掌握小鼠发育规律的基础上,本实验设计在小鼠注射HCG后60、64、68 h,取交配见栓标记的小鼠输卵管冲胚,统计小鼠胚胎发育阶段,结果显示在注射HCG后64h冲胚,得到的8细胞数最多,占总胚胎数的76.9%,与注射HCG后60h的8细胞发育率33.8%相比差异显著（p＜0.05）,和注射HCG后68h的8细胞发育率63.6%相比差异不显著（p＞0.05）;注射HCG后68h,部分胚胎已经发育到桑葚胚,所以在注射HCG后64～68h之间冲胚可以得到较多的8细胞期胚胎1.4小鼠孤雌胚胎与雄性胚胎嵌合发育生成囊胚的研究应用双重PCR性别鉴定技术对获取的有性生殖8细胞胚胎进行性别鉴定,获得雄性8细胞胚胎后与孤雌生殖8细胞胚胎进行嵌合培养,同时在相同培养条件下以有性生殖8细胞胚胎和孤雌胚胎的发育培养作为对照,观察嵌合胚胎的发育效果,旨在研究小鼠雄性胚胎辅助与其嵌合发育的孤雌胚胎的囊胚生成情况,为其后的实验奠定基础,结果显示嵌合胚胎在体外培养可以发育至囊胚,其囊胚发育率为39.4%,比孤雌生殖8细胞胚胎囊胚发育率35.1%略高,差异不显著（p＞0.05）,与有性生殖胚胎体外培养的囊胚率90.6%相比,差异显著（p＜0.05）。2孤雌囊胚内细胞团离散细胞的集落生成及其不同性别来源比率研究本研究是在本实验室应用双重PCR性别鉴定技术建立昆白小鼠雄性胚胎嵌合孤雌胚胎辅助发育的研究模式基础上,试验一进一步研究了影响两种不同类型胚胎细胞嵌合发育的几个关键性问题,以此为基础,又一次应用双重PCR性别鉴定技术对由嵌合孤雌囊胚分离获取的离散细胞所生成的集落进行了性别来源标记,统计分析了这种嵌合孤雌囊胚中两种不同性别来源细胞的比率。其目的是为了提高这种新的异性胚胎嵌合培养辅助发育的效果和研究这种嵌合性囊胚内细胞团中含有所需孤雌胚胎细胞的比率,为未来进一步研究从这种嵌合的囊胚中获取治疗性孤雌胚胎干细胞奠定基础。2.1小鼠胎儿成纤维细胞的分离、培养及饲养层的制备方法研究本试验收集13.5d的小鼠胎儿,分离胎儿成纤维细胞（MEF）。分离培养的原代小鼠胚胎成纤维细胞,1天后即可见大量细胞贴壁生长,大多数细胞呈梭形,并可见少量周围细胞呈放射状生长,也可见少数圆形或不规则形杂质细胞,约3天细胞大致能长满瓶底,长满后细胞致密呈长梭形。取生长较好的第3代MEF用丝裂霉素处理后铺层于明胶包被的四孔板制备饲养层。2.2小鼠孤雌胚胎和雄性胚胎嵌合发育囊胚内细胞团的离散培养研究本实验共对6枚嵌合囊胚内细胞团进行了单细胞分离,平均每个内细胞团消化分离后可收集到11.83个单细胞,将单细胞进行培养增殖后发现,有5枚嵌合囊胚的内细胞团单细胞能够在体外增殖。平均每个嵌合囊胚可得到1.67个细胞集落。2.3嵌合体囊胚内细胞团离散细胞不同性别来源比率研究对获得的细胞集落进行性别鉴定检测后发现,孤雌胚胎来源集落与雄性胚胎来源集落的比例为5:12。试验结果表明,应用双引物双重PCR性别鉴定方法可对嵌合囊胚内细胞团中孤雌胚胎细胞来源进行检测。综上所述,小鼠MⅡ期卵母细胞经10mmol/L的Srcl₂和5ug/mlCB联合作用4h后,得到较多的杂合二倍体胚胎,于CZB+15%FBS培养液中培养,当胚胎发育至4-cell时就换CZB+15%FBS+1.1mg/mlGlu培养液,培养到8-细胞;在小鼠超排注射HCG后64～68h,取见栓标记小鼠,从输卵管获取8-细胞期胚胎,经性别鉴定选择雄性胚胎与8-细胞孤雌胚胎嵌合培养,其囊胚发育率略高于孤雌胚胎的囊胚发育率,表明嵌合后,小鼠雄性胚胎对孤雌胚胎的发育有一定程度的辅助作用。取嵌合后囊胚内细胞团,分散为单细胞于小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上培养至生成细胞集落,用PCR性别鉴定方法成功的分离到孤雌胚胎的细胞集落,由所得的孤雌胚胎与雄性胚胎的细胞集落的比率可以看出,在嵌合胚胎发育的过程中,雄性胚胎的发育占优势地位。