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水稻作为我国主要的粮食作物,保证其产量对粮食安全战略具有重要意义。水稻产量不但受粒型、千粒重、结实率的影响,还与株高、叶型、穗型、穗粒数等密切相关。因此,对水稻产量相关基因进行克隆分析便显得十分重要。我们之前的研究发现,水稻粒型调控基因OsGRF4可以与OsGIF1直接互作形成转录复合体作用于其下游的靶基因,进而调节水稻粒型。然而,对于OsGIF1是否参与水稻其它发育过程,是否影响其他农艺性状仍不清楚。因此,为了探究OsGIF1的功能,本研究通过包括敲除、过表达、表达模式分析和亚细胞定位在内的一系列研究手段,对该基因的功能进行进一步的分析。主要结果如下:
1、利用CRISPR/CAS9技术对OsGIF1进行敲除分析。结果显示,在两个不同的靶点区域,OsGIF1的30株敲除单株表现出了五种不同类型的纯合基因突变:A/T碱基插入,3/18/10碱基缺失,说明目标基因定点编辑成功。对突变体和野生型的表型对比观察显示,OsGIF1敲除植株主要在株高上出现不同程度的变矮,分别表现为轻微矮化,中度矮化,极度矮化。这种植株的矮化与OsGIF1基因敲除所致的蛋白序列变化程度相关,如A,T碱基插入会导致OsGIF1所编码的蛋白提前终止,其相应植株也出现极度矮化。同时我们未发现明显的脱靶效应。因此,上述结果证明:突变体植株的表型是由OsGIF1突变造成的,而敲出植株表型的多样性,可能是由于OsGIF1功能丧失程度不同所导致的。
2、OsGIF1的敲除会影响水稻多个发育进程。我们从OsGIF1的敲除植株中选择了T408-14、T408-6和T409-17三种具有代表性的纯合突变单株,通过与野生型植株的对比,从而对OsGIF1的功能进行分析。结果显示:三种敲除单株的株高变矮,茎节变短,表明OsGIF1功能缺失导致茎节长度变短,从而水稻株高变矮。同时,敲除单株的叶长变短,叶宽变窄,突变表型严重的T408-6和T409-17叶片卷曲度变大。表明OsGIF1通过调节叶片的大小和卷曲度从而影响水稻叶片的生长发育。此外, OsGIF1敲除突变体单株的千粒重,粒长,粒宽显著性降低,表明OsGIF1影响水稻籽粒的生长发育。并且,OsGIF1敲除突变体单株还出现了花器官的发育异常和结实率的明显降低,尤以T409-17表现最为明显,几乎为完全不育。表明OsGIF1对水稻花器官的生长发育过程亦具有调节作用。
3、OsGIF1的过表达会增大水稻多个器官的大小。以2x35S为启动子驱动OsGIF1进行过量表达。结果显示,与野生型相比,过表达植株的粒长、粒宽和千粒重均极显著提高。同时,OsGIF1过表达植株的叶片长度,叶片宽度均显著增大。而且,OsGIF1的过表达也会影响到植株株高。上述结果表明,OsGIF1过表达能增加水稻多个器官大小,对水稻多个器官起着正向调控的作用。
4、OsGIF1通过控制细胞扩张来调控水稻器官大小。利用石蜡切片对野生型和OsGIF1敲除单株的茎与叶进行细胞学对比观察分析,发现突变体茎纵切、横切和叶横切单位面积内的细胞数量均显著增多,细胞大小均明显减小。同时,利用扫描电子显微镜对野生型、过表达和敲除植株的颖壳进行观察,发现过表达单株颖壳细胞体积明显增大,而敲除单株颖壳细胞体积明显减小。上述结果表明,OsGIF1主要通过细胞扩张来增大水稻多个主要器官(茎、叶和籽粒)的大小。
5、除了细胞大小的变化,还观察到细胞的其它异常:敲除植株茎中厚壁组织细胞的层数和维管束的数目明显减少,其大小也明显减小,甚至个别敲除单株的外维管束还出现发育不完全的现象;在极度矮化敲除植株的叶片中,叶片的泡状细胞数量明显多于野生型,从而打破了AD-AB模式的平衡,最终导致叶片出现卷叶;此外,扫描电子显微镜观察发现,OsGIF1过表达和敲除植株叶和茎的外表面硅质细胞的排布、气孔保卫细胞的形态、数目及排布方式等都与野生型有明显的差异。这些结果表明,在水稻器官或组织生长发育中OsGIF1也可能影响其他细胞进程。
6、OsGIF1基因的组织表达模式。利用GUS报告基因系统和qRT-PCR对OsGIF1进行表达模式分析,结果显示,OsGIF1在根和成熟的颖壳中表达量相对较弱,但是在茎节间、茎结,以及发育中的小穗表达量要强一些,特别是在发育中的花药中其表达量尤为强烈。总的来说,OsGIF1表达模式与其功能基本吻合。
7、OsGIF1蛋白细胞定位。为了确定OsGIF1在细胞内的表达位置,通过构建OsGIF1-YFP表达载体,瞬时转化进水稻原生质体后进行亚细胞定位。观察结果显示OsGIF1-YFP主要定位在细胞核上,但其在细胞质上有微弱的表达。这一结果与我们的预期相吻合,即OsGIF1与OsGRF4转录因子形成复合体,从而作为转录共激活因子米行使其功能。
1、利用CRISPR/CAS9技术对OsGIF1进行敲除分析。结果显示,在两个不同的靶点区域,OsGIF1的30株敲除单株表现出了五种不同类型的纯合基因突变:A/T碱基插入,3/18/10碱基缺失,说明目标基因定点编辑成功。对突变体和野生型的表型对比观察显示,OsGIF1敲除植株主要在株高上出现不同程度的变矮,分别表现为轻微矮化,中度矮化,极度矮化。这种植株的矮化与OsGIF1基因敲除所致的蛋白序列变化程度相关,如A,T碱基插入会导致OsGIF1所编码的蛋白提前终止,其相应植株也出现极度矮化。同时我们未发现明显的脱靶效应。因此,上述结果证明:突变体植株的表型是由OsGIF1突变造成的,而敲出植株表型的多样性,可能是由于OsGIF1功能丧失程度不同所导致的。
2、OsGIF1的敲除会影响水稻多个发育进程。我们从OsGIF1的敲除植株中选择了T408-14、T408-6和T409-17三种具有代表性的纯合突变单株,通过与野生型植株的对比,从而对OsGIF1的功能进行分析。结果显示:三种敲除单株的株高变矮,茎节变短,表明OsGIF1功能缺失导致茎节长度变短,从而水稻株高变矮。同时,敲除单株的叶长变短,叶宽变窄,突变表型严重的T408-6和T409-17叶片卷曲度变大。表明OsGIF1通过调节叶片的大小和卷曲度从而影响水稻叶片的生长发育。此外, OsGIF1敲除突变体单株的千粒重,粒长,粒宽显著性降低,表明OsGIF1影响水稻籽粒的生长发育。并且,OsGIF1敲除突变体单株还出现了花器官的发育异常和结实率的明显降低,尤以T409-17表现最为明显,几乎为完全不育。表明OsGIF1对水稻花器官的生长发育过程亦具有调节作用。
3、OsGIF1的过表达会增大水稻多个器官的大小。以2x35S为启动子驱动OsGIF1进行过量表达。结果显示,与野生型相比,过表达植株的粒长、粒宽和千粒重均极显著提高。同时,OsGIF1过表达植株的叶片长度,叶片宽度均显著增大。而且,OsGIF1的过表达也会影响到植株株高。上述结果表明,OsGIF1过表达能增加水稻多个器官大小,对水稻多个器官起着正向调控的作用。
4、OsGIF1通过控制细胞扩张来调控水稻器官大小。利用石蜡切片对野生型和OsGIF1敲除单株的茎与叶进行细胞学对比观察分析,发现突变体茎纵切、横切和叶横切单位面积内的细胞数量均显著增多,细胞大小均明显减小。同时,利用扫描电子显微镜对野生型、过表达和敲除植株的颖壳进行观察,发现过表达单株颖壳细胞体积明显增大,而敲除单株颖壳细胞体积明显减小。上述结果表明,OsGIF1主要通过细胞扩张来增大水稻多个主要器官(茎、叶和籽粒)的大小。
5、除了细胞大小的变化,还观察到细胞的其它异常:敲除植株茎中厚壁组织细胞的层数和维管束的数目明显减少,其大小也明显减小,甚至个别敲除单株的外维管束还出现发育不完全的现象;在极度矮化敲除植株的叶片中,叶片的泡状细胞数量明显多于野生型,从而打破了AD-AB模式的平衡,最终导致叶片出现卷叶;此外,扫描电子显微镜观察发现,OsGIF1过表达和敲除植株叶和茎的外表面硅质细胞的排布、气孔保卫细胞的形态、数目及排布方式等都与野生型有明显的差异。这些结果表明,在水稻器官或组织生长发育中OsGIF1也可能影响其他细胞进程。
6、OsGIF1基因的组织表达模式。利用GUS报告基因系统和qRT-PCR对OsGIF1进行表达模式分析,结果显示,OsGIF1在根和成熟的颖壳中表达量相对较弱,但是在茎节间、茎结,以及发育中的小穗表达量要强一些,特别是在发育中的花药中其表达量尤为强烈。总的来说,OsGIF1表达模式与其功能基本吻合。
7、OsGIF1蛋白细胞定位。为了确定OsGIF1在细胞内的表达位置,通过构建OsGIF1-YFP表达载体,瞬时转化进水稻原生质体后进行亚细胞定位。观察结果显示OsGIF1-YFP主要定位在细胞核上,但其在细胞质上有微弱的表达。这一结果与我们的预期相吻合,即OsGIF1与OsGRF4转录因子形成复合体,从而作为转录共激活因子米行使其功能。