结核分枝杆菌H37Rv全基因组中,编码PE/PPE蛋白家族的基因约占10%,研究表明该家族蛋白与结核分枝杆菌侵染宿主时机体发起的一系列免疫应答有关,本课题选择PE19蛋白作为研究对象,PE19蛋白是结核分枝杆菌中Ⅶ型分泌系统中ESX-5系统的组成相关蛋白,该系统与结核分枝杆菌的PE/PPE蛋白的分泌有关。本课题主要是利用克隆技术,将目的基因克隆到原核载体上,经IPTG诱导表达产生融合蛋白,经纯化后得到目的蛋白,然后利用ELISPOT技术,对其免疫原性进行初步探究。首先,利用两种不同的克隆法构建了 4中重组质粒,通过试表达实验,得到有可溶性融合蛋白表达的菌株。进行大量表达并纯化,比较纯化结果,最终确定选用经重组质粒pMCSG7-PE19诱导表达的His6-PE19作为抗原进行免疫原性初探实验。本课题利用LIC克隆法构建了 pMCSG7-PE19。LIC克隆法有许多优点,该方法可以满足高通量克隆要求,质粒和基因的处理都比较简单,设计引物时不需要考虑酶切位点,只需在上下游引物的两端分别加上特定序列即可,对插入基因没有特殊要求,既节省时间也节约经费。最后,通过ELISPOT技术,检测PE19是否会引起效应T细胞产生特异性免疫应答,释放Y干扰素,对PE19蛋白的免疫原性进行探究。本课题涉及的样本中,PE19与抗原B的检出率一样,说明PE19有潜力成为ELISPOT中的特异性免疫试剂。且检出的病人样本存在少量不一致样本,说明PE19有潜力成为抗原A与抗原B的补充试剂或补充肽。由于样本数量有限,针对PE19蛋白的免疫原性的敏感性和特异性,需要扩大实验样本数量,才能得到较为严谨的结论。通过实验,证明PE19蛋白确实可以作为抗原,引起受结核感染的机体产生特异性免疫应答。