代谢网络是通过生物信息学手段将菌体内部的基因、酶、代谢反应之间的相关性进行关联形成一个复杂的网络形态结构。代谢通量分析(MFA)则是基于物料守恒的原理,通过数学模型了解微生物在发酵过程中的代谢通量分布,从而进一步掌握微生物的代谢规律。大量的研究结果表明,微生物的代谢产物积累主要受到遗传因素和外界环境条件因素的影响。实验室前期试验发现溶氧和信号转导对粘质沙雷氏菌代谢具有很大的影响,另外不同种属的粘质沙雷氏菌在代谢方面也存在明显差异。为此,本论文重点考察了不同通气速率、遗传特性以及信号分子对粘质沙雷氏菌代谢通量分布的影响,实验结果如下:1.S.marcescens H32代谢网络构建及其不同通气速率条件下代谢分布本章节主要考察不同通气条件对S.marcescens H32代谢分布的影响,实验结果表明,1.5 L/min通气速率的条件下,S.marcescens H32的2,3-丁二醇与琥拍酸产物浓度与代谢分布上有所提高。在乙偶姻与乙醇产物积累上,0.8 L/min通气速率的条件下其浓度与分布更高。因此S.marcescens H32发酵时,在低溶氧条件下,通气速率适当的提高,有利于2,3-丁二醇与琥珀酸产生,抑制了乙偶姻与乙醇的积累,发酵稳定期NAD+/NADH的比例大于0.8 L/min,2,3-丁二醇脱氢酶、延胡索酸还原酶活力有所提高,同时乙醇脱氢酶活力降低。2.S.marcescens H32 与 S.marcescens MG1 的代谢差异分析本章节主要探索S.marcescens H32与S.marcescens MG1在代谢上的差异,实验室前期发现S.marcescens MG1与S.marcescens H32这两株菌在发酵过程中代谢上存在明显差异。在相同的发酵条件下,测定发酵过程中代谢产物浓度与各酶活力的变化情况并进行代谢通量分析。产物测定结果表明,S.marcescens H32在乙醇、乙偶姻、乙酸、玻拍酸的浓度与分布均高于S.marcescens MG1,而S.marcescens MG1在2,3-丁二醇产物、柠檬酸的产量与分布上明显高于S.marcescens H32。S.marcescens H32 的 NAD+/NADH 在发酵稳定期显著高于 S.marcescens MG1,乙醇脱氢酶与延胡索酸还原酶活力也高于S.marcescens MG1,而2,3-丁二醇脱氢酶活力明显低于后者,因此代谢过程中酶活力和还原力的测定结果表明两株菌代谢差异主要是由于2,3-丁二醇脱氢酶活力及NADH可用率导致的。3.信号分子对S.marcescens H32代谢通量分布的影响本章节主要采用代谢通量分析了实验室前期已构建的粘质沙雷氏菌信号分子合成酶基因缺失菌株和S.marcescens H32代谢通量的差异。结果表明,信号分子合成酶基因的缺失,抑制了菌体的生长,降低了菌体的耗糖能力,提高了乙醇、乙偶姻以及乙酸、乳酸和琥珀酸有机酸的积累,大大降低了 2,3-丁二醇的积累。通过酶活力测定结果表明,信号分子合成酶基因的缺失,降低了 2,3-丁二醇脱氢酶和乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶活力,提高了延胡索酸还原酶活力,因此信号分子主要通过调控2,3-丁二醇从而导致了整个代谢通量分布的变化。通过外部添加10μM标准信号分子C6-HLS进行发酵,信号分子合成酶基因缺陷菌株的酶活力与代谢物的积累得到一定的恢复。4.信号分子合成酶基因过表达工程菌S.marcescens MG1/pBud-swrI的构建本章节将粘质沙雷氏菌的信号分子合成酶基因swrI连接到pBud质粒上,电转至野生型粘质沙雷,获得粘质沙雷氏菌信号分子合成酶基因过表达菌。该信号分子合成酶基因swrI的引入明显的提高了细胞中的信号分子合成酶含量,但是由于质粒的插入影响到菌体的生长和代谢分布,有待进一步完善。通过对粘质沙雷氏菌在不同条件调控下的代谢分布分析,了解通气速率、遗传特性和信号分子对粘质沙雷氏菌代谢产物的影响及其主要节点,可以为粘质沙雷氏菌发酵优化与改造提供科学依据。