研究背景:牙周炎是一种由微生物和宿主免疫系统之间相互作用引起的慢性炎症性疾病。该疾病对牙齿的支持结构(牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质)造成持续性不可逆转的破坏,是导致牙齿缺失的首要原因。不仅如此,有研究表明牙周炎与全身系统性疾病关系密切。作为牙周炎致病菌,牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis,Pg)能引发肠道菌群的改变,导致肠上皮通透性的增加,并引发系统炎症而导致内毒素血症的发生,进而增加了患动脉粥样硬化、不良妊娠结局(早产儿、低体重儿等)、风湿性关节炎、吸入性肺炎以及癌症等的风险。然而口服抗生素治疗牙周炎存在诸多缺点,如牙周袋内抗生素浓度不足、血浆内抗生素浓度迅速下降至亚治疗水平,长期亚治疗剂量容易引发微生物耐药性等。因此局部药物递送系统成为目前的研究热点,该系统在治疗期间为牙周组织提供有效浓度的药物,大大提高药物的治疗效果,同时减少副作用的发生。本研究采用壳聚糖-β-甘油磷酸钠-明胶可注射温敏型水凝胶作为局部药物载体,水凝胶具有临床操作简便、注射所需创口面积小、液体状态下具有流动性可充填于不规则组织缺损腔隙等诸多优点。其主要组成成分壳聚糖作为药物载体,可起到控制药物释放、延长药效、降低毒副作用、提高疏水性药物稳定性和改变给药途径等作用,还能增强载体的靶向给药能力。FK506也称他克莫司(tacrolimus),是从链霉菌属中提取出来的一种抗生素,也是临床常用的强效免疫抑制剂。近年来多项研究发现,FK506具有抗炎以及促进骨形成和骨缺损修复作用。由于抗炎与促进骨形成是促进牙周组织完全恢复的关键靶点,因此,这些研究提示FK506在牙周炎的治疗中具有良好的应用前景。研究目的:本研究通过体外细胞实验筛选合适的FK506浓度,检测正常环境下适宜浓度的FK506对细胞成骨分化的影响。同时制备壳聚糖-β-甘油磷酸钠-明胶可注射温敏型水凝胶,通过局部缓释具有抗炎以及促进成骨分化作用的FK506,研究其在大鼠牙周炎模型中的治疗作用,为FK506在口腔临床应用提供理论基础,以期研制新型牙周炎治疗制剂。研究方法:1.体外细胞实验研究成骨分化:分离培养hDPSCs,通过CCK-8法检测FK506合适的使用浓度,Real-time PCR检测FK506对hDPSCs成骨相关基因(RUNX2、ALP、COL-I、OPN和OCN)表达的影响,并进行茜素红染色及CPC定量分析。明确FK506对hDPSCs细胞增殖和成骨分化的作用。2.材料的制备与表征:以壳聚糖(chitosan,CS)、β-甘油磷酸钠、明胶和FK506为原料合成载FK506可注射温敏型水凝胶,扫描电镜下观察其微结构,MTT法检测载FK506水凝胶的体外细胞毒性。3.体内动物实验:建立Wistar大鼠牙周炎模型,分别注射水凝胶、FK506及载FK506水凝胶至上颌第一磨牙近远中牙周袋内,手术2周后取上颌磨牙区组织块。采用micro-CT观察牙周骨组织破坏、再生情况,HE染色进行组织学分析,并结合免疫组织化学染色检测炎症因子COX-2和MMP-9的表达情况。探讨以载FK506可注射温敏型水凝胶体系作为牙周药物缓释体系,控制牙周炎、促进牙周组织再生的可行性。通过对重要脏器H&E染色检测水凝胶载FK506的体内毒性。研究结果:RT-PCR检测结果表明,FK506显著促进hDPSCs细胞成骨分化过程中Runx2,ALP,COL-I,OCN和OPN的表达。茜素红染色结果显示FK506有效地促进了hDPSCs细胞外基质矿化。扫描电镜图像显示,水凝胶孔径均一。MTT结果显示水凝胶载FK506对hDPSCs细胞的增殖活性无明显抑制作用。Micro-CT扫描分析结果表明,水凝胶载FK506可以减轻牙周炎导致的牙槽骨破坏。组织学分析表明,在水凝胶载FK506治疗组中几乎没有炎性细胞浸润或牙槽骨破坏,并且在根分叉区以及上颌第一和第二磨牙之间可见少量新生骨组织。此外,免疫组化结果显示,FK506组或水凝胶+FK506组中COX-2和MMP-9阳性细胞明显减少。研究结论:可注射温敏型水凝胶缓释FK506可用于抗炎和牙周组织再生,在牙周炎治疗中具有良好的研究与应用前景。