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目的研究非特异性炎症因子脂多糖(Lipopolysaccharide LPS)对正常胃粘膜上皮细胞株(Immortalized ’Normal’Gastric Epithelial Cells, GES-1)抑癌基因p16INK4A启动子甲基化及其mRNA表达的影响,探讨非特异性炎症与胃癌相关抑癌基因启动子甲基化的关系,为研究非特异性炎症与肿瘤发生的关系提供新的分子机制和理论依据。方法1.建立非特异性感染的细胞炎症模型：用浓度为10,000ng/mL的大肠杆菌脂多糖分别刺激GES-1细胞24h,48h和72h。以未刺激的GES-1细胞作空白对照。2.甲基化特异性PCR (methylation-specific polymerase chain reaction MSP)法检测p16INK4A基因启动子甲基化：提取LPS刺激细胞的基因组DNA,用甲基化硫化试剂盒硫化处理并纯化。然后用MSP法检测p16INK4A基因启动子甲基化变化。3.实时荧光定量PCR (quantitative reverse transcription-PCR, qRT-PCR)法检测p16INK4A基因mRNA表达：提取LPS刺激细胞的总RNA后用qRT-PCR法检测p161NK4A基因mRNA表达情况；4.检测总甲基化转移酶(Total DNA methyltransferase, tDNMT)的活性：提取LPS刺激细胞的核蛋白后用甲基化转移酶激活试剂盒(EpiQuik DNA Methyltransferase Activity Assay Kit)检测tDNMT的活性。5.检测细胞的增殖活性：用MTT法检测不同浓度的LPS(分别为10ng/mL,100ng/mL,1,000ng/mL和10,000ng/mL)及不同刺激时间(24h,48h和72h)后GES-1细胞的增殖活性。结果1.LPS对p16INK4A基因启动子甲基化的诱导作用：LPS刺激24小时后,p16INK4A基因启动子区发生了少部分甲基化改变；刺激48小时后,p16INK4A基因启动子区甲基化改变增加；而刺激72小时后,p16INK4A基因启动子区发生了完全甲基化。2.LPS对p16INK4A基因mRNA表达的影响：LPS刺激24h,48h及72h后,p16INK4A基因mRNA表达量分别为0.7124±0.0738,0.6105±0.0651和0.3598±0.0328,LPS可以明显下调p16INK4A基因：mRNA的表达,并随着LPS刺激时间的延长,p16INK4A基因mRNA的表达下降的越明显(与未刺激细胞组比较,LPS刺激GES-1细胞24小时、48小时和72小时后p16INK4A基因mRNA的分别下调了约1.40倍、1.64倍和2.78倍)(差异均有统计学意义,P<0.05)。3.LPS对总甲基化转移酶活性的影响：LPS刺激24h,48h及72h后,tDNMT的激活率分别为7.8112±0.3376,8.7837±0.4720和10.5089±0.3581,LPS刺激后GES-1细胞中DNA甲基化转移酶的活性率明显增强(P<0.05),并随着刺激时间的延长,tDNMT的活性率增加明显(LPS刺激GES-1细胞24小时、48小时和72小时后总的tDNMT激活率分别是空白对照组的3.05倍、3.43倍和4.12倍)(差异均有统计学意义,P<0.05)4.LPS对GES-1细胞增殖活性的影响：培养24小时后,LPS对GES-1细胞增殖的影响较对照组无明显差异(P>0.05),且不同浓度LPS组之间的吸光值也无显著性差异(P>0.05)。当48小时和72小时,LPS组GES-1细胞的吸光值明显高于对照组(P<0.05),且不同浓度LPS组GES-1细胞的吸光值存在差异,随着LPS浓度的增加,GES-1细胞的吸光值逐渐升高(P<0.05)。结论1.非特异炎症因子LPS可以诱导GES-1细胞株抑癌基因16INK4A启动子区发生甲基化改变。2.LpS通过激活DNA甲基化转移酶来诱导p16INK4A启动子区甲基化。3.LPS诱导的p16INK4A启动子区甲基化下调了p16INK4A基因mRNA表达,进而促进了GES-1细胞增殖。