Periostin又称为成骨细胞特异性因子2（osteoblast-specific factor 2，OSF-2），是近几年来新确定的一种骨粘附分子，其分于量约90kDa，主要由成骨细胞及其前体细胞所分泌产生，可有效促进成骨细胞的粘附和伸展，并特异地表达于骨膜和牙周膜组织，在骨及牙齿的形成过程中可能起着独特的作用。目前，学者们己从小鼠和人的cDNA文库中克隆到Periostin基因，该基因与昆虫胚胎的中枢神经系统粘附分子fasciclinⅠ属同一家族，结构中均含有4个相似的重复序列，且其主要功能均为细胞粘附作用。但Periostin作为成骨细胞特异表达的分子，其在矿化组织形成中的作用尚不十分清楚，而有关这方面的研究正逐渐受到学者们的关注。本课题为了对Periostin的结构与功能有更深入的认识，采用分子生物学技术，对小鼠Periostin C端cDNA进行了克隆，原核表达和纯化，并制备了抗Periostin抗体，进行了蛋白印迹（Western blot）和免疫组化的研究，从蛋白和分子水平探讨了Periostin的组织表达特异性，同时利用所获得的具有活性的Periostin，研究了其对牙周膜细胞的一系列生物学效应，为今后进一步研究其生理功能和用于临床奠定了基础。本研究分为以下4部分： 一、小鼠Periostin C端编码区cDNA克隆及其序列分析 采用异硫氰酸胍一步法从成年昆明小鼠牙周组织中抽提总RNA，用Oligo(dt)作引物逆转录合成cDNA，然后利用PCR技术，从cDNA中扩增出小鼠Periostin C末端编码区的基因片段（约940bp），将所得基因片段插入pRSET-B载体，转化大肠杆菌DH5α后随机挑选数个克隆，提取质粒DNA，通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果表明：重组 第凹军医大学博士学位论义一质粒pRSETE干eriostin的酶切图谱和序列分析结果与国外文献报道的序列一致。 二、小鼠互组Perinstin C端肤在大肠杆菌中的表达及活性鉴定 将编码小鼠 Periostin C端肽的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体 —”””——”————”’—””一’——～’ 一 尽pRSETS上，使其受控于 T7启动于，构建成表达质粒pRS七Ieriostin，以大肠杆菌 E．COlt BL21（DE3）为宿主菌。对工程菌用异丙基硫代一p—D一半乳糖苦（IPTG）诱导表达，表达产物纯化后进行复性处理，再通过观察成骨细胞的粘附性和伸展性检测其生物学活性。结果显示：经IP＊G诱导sh，工程菌在SDS．PAGE上出现一条新蛋白带，分子质量与预期的一致约为36kDa，主要以包涵体形式存在，所得包涵体经纯化和复性处理，得到纯度高于 95％的小鼠重组 Periostin C端肽。 为检测重组Periostin的活性，采用固相结合分析实验以及四陛盐比色 （MTT法）等细胞生物学技术，观察成骨细胞在 Periostin基质上的粘附能力和伸展率。结果表明：成骨细胞在Perio悦in基质上的粘附和伸展良好，当浓度在20m勿L以上时，作用尤其显著（P＜0．01），与在纤维结合蛋白（FN）基质上生长相似。即小鼠重组Periostin可有效促进成骨细胞的粘附和伸展。 三、抗Pertostin抗体的制合和组织裹达特异性研究 以重组、纯化的小鼠Periostin为抗原，混入弗氏完全佐剂充分乳化后，免疫新西兰大白兔：用双向免疫扩散试验检测抗体效价，将获得的多克隆抗血清初步纯化后，用Western blot和免疫组化检测小鼠Periostin的组织表达特异性。Western blot显示：在小鼠颅盖骨及牙周组织总蛋白中有特异性表达，而在肝、肾和脑组织总蛋白中没有表达。免疫组化检测，下颌骨表面骨膜和牙周膜组织中的Periostin染色呈强阳性，而在牙骨质、牙本质、 第4页 共98页 第＊军医大学博士学位论义 一 牙槽骨和牙髓组织中则为阴性，提示Periostin在这两种组织中的高水平表 4。 四、Periostin对人牙周膜细胞的生物学作用 1．为了了解小鼠重组 Periostin对牙周膜细胞（PDL细胞）粘附、伸展 及移动的影响，我们采用了固相结合分析以及细胞机械创伤模型等方法， 0＿＿＿、＿、＿ 观察PDL细胞在Periostin基质上的粘附率。伸展率及其定向移动的能力。 结果显示：Periostin可促进PDL细胞的粘附、伸展和移动，且当浓度在40 mg几时，作用最为显著。 2．应用Mry比色试验及酶动力学方法，测定了小鼠重组Periostin对 PDL细胞的增殖和 ALP活性的作用。观察到 Periostin仅在浓度为 40mg／L 时，可显著促进PDL 细胞的增殖，其余浓度则无作用，而其浓度在 10mg几－80mg几范围中时，均可显著提高 PDL细胞 ALP活性水平，说明 小鼠重组Periostin对PDL?