研究背景胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,预后很差。在我国,其发病率及死亡率居所有恶性肿瘤之首。多数患者在就诊时就已经发生了远隔脏器的侵袭和转移。在恶性肿瘤细胞的侵袭过程中,随着细胞粘附分子(如整合素)表达的改变,肿瘤细胞之间的粘附能力减弱,肿瘤细胞与基底膜之间的粘附能力增强;在此基础上,恶性肿瘤细胞分泌并释放蛋白溶解酶(如基质金属蛋白酶)降解细胞外基质,破坏基底膜的完整性;一旦基底膜遭到破坏,恶性肿瘤细胞就会以阿米巴运动穿过基底膜的缺损部位,不断溶解并游走于间质的结缔组织,最终到达血管壁或淋巴管壁,再以同样的方式穿过血管或淋巴管的基底膜进入循环系统,从而实现远隔部位的转移。可见,侵袭和转移是恶性肿瘤细胞同一生物学行为(游走和溶解)的不同表现,本质上并没有明显的区别;其中,细胞粘附能力的改变和基质溶解能力的增强是最核心的两个环节,共同促进恶性肿瘤细胞不断游走和溶解的恶性行为。整合素家族是由α亚基和β亚基通过非共价键连接形成的异二聚体的跨膜蛋白受体。其中,胞外部分通过识别配体肽链中的RGD (Arg-Gly-Asp)序列,介导了细胞和细胞外基质的粘附和信号传导;而胞内部分的β亚基含有胞内信号分子的结合位点,当整合素接受胞外刺激后会聚合成簇,引发胞内区域构象的改变,激活粘附斑激酶FAK,募集胞浆衔接蛋白talin等,从而介导了胞内信号途径的传导。前期研究证实,整合素αυβ6是整合素家族中唯一一种含有β6亚基的整合素,而且只在恶性病变上皮组织中表达,已经在结肠癌、胰腺癌、乳腺癌以及口咽部癌等恶性肿瘤的研究中取得了重要的成果,可以作为胃癌和结肠癌患者不良预后的指示因子。基质金属蛋白酶(matrix-metalloproteinases,MMPs)最早发现于1962年,因其需要Zn2+等金属离子作为辅助因子而得名。MMPs是一个蛋白水解酶家族,由信号肽域、前肽域、催化域、铰链区和血红素结合蛋白样或纤维结合素样的COOH末端域5个结构域构成,在组织重塑过程中发挥重要的作用。MMPs几乎能降解ECM中除了多糖之外的所有蛋白成分,破坏细胞迁移过程中遇到的各种组织学屏障。因此,MMPs在恶性肿瘤细胞侵袭和转移中的作用日益受到重视,被认为是该过程中发挥主要作用的蛋白水解酶。基质金属蛋白酶MMP-9作为MMPs中的重要一员,通过降解明胶和Ⅳ型胶原,在恶性肿瘤的侵袭和转移中起着举足轻重的作用。既往研究证实,MMP-9与胰腺癌、非小细胞肺癌的不良预后相关。基于这一理论,我们设想,既然整合素ανβ6是重要的细胞粘附分子并在恶性肿瘤细胞中表达上调,而MMP-9作为MMPs家族中的重要一员,在恶性肿瘤细胞中分泌增加并参与溶解细胞外基质,两者在胃癌的侵袭转移中或许存在协同作用。MMP-9作为ανβ6的下游靶向因子,参与了结肠癌的恶性行为,但两者联合表达在胃癌预后中的作用尚未曾研究。基于以上背景,我们不仅会想,联合检测ανβ6和MMP-9是否会更有效的预测胃癌的预后呢?第一部分 整合素ανβ6和MMP-9在胃癌预后中的作用研究目的检测整合素ανβ6和基质金属蛋白酶MMP-9在胃癌组织中的表达,分析两者阳性表达与预后因子的相关性,评估它们在胃癌预后监测中的作用。方法1.采用免疫组织化学方法检测整合素ανβ6和基质金属蛋白酶MMP-9在126例原发性胃癌组织中的表达。2.所有组织样本的免疫组化染色结果和各种临床病理指标之间的相关性分析,通过卡方检验完成评估。3.整合素ανβ6和基质金属蛋白酶MMP-9阳性表达的相关性分析,通过双变量相关分析完成评估。4.患者术后随访3个月一次,两年之后至少6个月一次,中位随访时间为56个月。5.按照整合素ανβ6和基质金属蛋白酶MMP-9的不同表达组合,将患者分为四组:ανβ6 (+) /MMP-9 (+)组、ανβ6 (-) /MMP-9 (-)组、ανβ6 (+) /MMP-9(-)组和ανβ6(-) /MMP-9 ( + )组,以便分析不同组合在胃癌预后中的相对作用。6.生存曲线之间的差异性由对数秩(Log-rank)检验完成评估,并采用Kaβlan-Meier生存分析和Cox比例风险回归模型最终评估独立的预后因子。结果1.整合素αυβ6和MMP-9在126例胃癌患者中明显高表达,其阳性表达率分别为 34.92%和 42.06%。2.与整合素αυβ6的阳性表达相关的临床因素为Lauren分型、分化、淋巴结分期和 TNM 分期(P 值分别为 0.006,0.038, 0.016 和 0.002),而与 MMP-9的阳性表达相关的临床因素为分化、肿瘤分期、淋巴结分期和TNM分期(P值分别为 0.039,0.014,0.033 和 0.008)。3.通过双变量相关分析证实,整合素αυβ6的阳性表达和MMP-9的阳性表达呈密切正相关。4. Kaplan-Meier生存分析表明,整合素αυβ6阳性表达或MMP-9阳性表达患者的生存时间比整合素αυβ6阴性表达或MMP-9阴性表达患者的生存时间短,而且整合素αυβ6和MMP-9都阳性表达的患者的生存时间最短(P值=0.000)。5. Cox比例风险回归模型显示,整合素αvβ6和MMP-9阳性表达、弥散型Lauren分型以及较高的N期、M期和TNM分期是影响胃癌不良预后的因素;只有整合素αυβ6和MMP-9是胃癌不良预后的独立指标(相关系数分别为2.632和 1.813, P 值分别为 0.003 和 0.007)。结论整合素αυβ6和基质金属蛋白酶MMP-9在胃癌中的高表达密切相关,两个指标联合检测在胃癌患者术后的预后监测中可作为更有效的预测指标。第二部分 整合素αυβ6对MMP-9表达的影响及其在胃癌细胞侵袭中的作用目的研究整合素αυβ6对基质金属蛋白酶MMP-9在mRNA和蛋白水平上表达的影响,以及整合素αυβ6和MMP-9在胃癌细胞侵袭、迁移中的作用。方法1.选用β6质粒转染以上调人胃癌前GES-1细胞中整合素αυβ6的表达,将GES-1细胞分成三组:对照组、空白质粒组和质粒上调组。通过western blot检测整合素αυβ6的表达,以检验β6质粒转染的效果,为进行后续实验做准备。2.选用脂质体转染siRNA以干扰人胃癌AGS细胞中整合素αυβ6的表达,将AGS细胞分成三组:对照组、siRNA阴性干扰组和siRNA干扰组。通过western blot检测整合素αυβ6的表达,以检验siRNA的干扰效果,为进行后续实验做准备。3.采用逆转录PCR技术,分别检测GES-1细胞和胃癌AGS细胞各组中MMP-9在mRNA水平的表达。4.采用ELISA的方法,分别检测GES-1细胞和胃癌AGS细胞各组中MMP-9在蛋白水平的表达。5.采用Transwell侵袭小室和细胞划痕实验,检测胃癌AGS各组细胞的侵袭和迁移能力的变化。结果1.人胃癌前GES-1细胞转染β6质粒后,经western blot证实,整合素αυβ6的表达在质粒上调组明显上调,空白质粒组中整合素αυβ6的表达相较于对照组没有明显差异,说明GES-1细胞中整合素αυβ6的上调效果明显,可用于后续研究。2.人胃癌AGS细胞转染siRNA后,经western blot证实,整合素αυβ6的表达在siRNA干扰组明显下调,siRNA阴性干扰组中整合素αυβ6的表达相较于对照组没有明显差异,说明AGS细胞中整合素αυβ6的干扰效果明显,可用于后续研究。3.逆转录PCR检测后发现,人胃癌前GES-1细胞经β6质粒过表达上调整合素αυβ6的表达后,基质金属蛋白酶MMP-9在mRNA水平相较于对照组也随之上调,而空白质粒组的MMP-9在mRNA水平相较于对照组没有明显差异;人胃癌AGS细胞经siRNA干扰下调整合素αυβ6的表达后,基质金属蛋白酶MMP-9在mRNA水平相较于对照组也随之下调,而siRNA阴性干扰组的MMP-9在mRNA水平相较于对照组没有明显差异。4. ELISA检测后发现,人胃癌前GES-1细胞经β6质粒过表达上调整合素αυβ6的表达后,基质金属蛋白酶MMP-9的蛋白水平相较于对照组也随之上调,而空白质粒组的MMP-9的蛋白水平相较于对照组没有明显差异;人胃癌AGS细胞经siRNA干扰下调整合素ανβ6的表达后,基质金属蛋白酶MMP-9的蛋白水平相较于对照组也随之下调,而siRNA阴性干扰组的MMP-9的蛋白水平相较于对照组没有明显差异。5. Transwell侵袭小室和细胞划痕实验检测后发现,人胃癌AGS细胞经siRNA干扰下调整合素ανβ6的表达后,细胞的侵袭和迁移能力相较于对照组也随之变弱,而siRNA阴性干扰组的侵袭和迁移能力相较于对照组没有明显差异。结论本部分实验表明,人胃癌前GES-1细胞经β6质粒过表达上调整合素ανβ6的表达后,MMP-9在mRNA和蛋白水平均明显上调;人胃癌AGS细胞经siRNA干扰下调整合素ανβ6的表达后,MMP-9在mRNA和蛋白水平均明显下调,且细胞的侵袭和迁移能力也随之变弱。整合素ανβ6通过调控MMP-9促进了胃癌细胞的恶性生物学行为。该部分研究从细胞的微观角度解释了整合素ανβ6和基质金属蛋白酶MMP-9在胃癌组织中的高表达密切相关以及在胃癌患者术后的预后监测中的作用。第三部分 ERK/MAPK信号通路介导整合素ανβ6调控MMP-9机制的研究目的研究ERK/MAPK信号通路对整合素ανβ6调控MMP-9影响。方法1.在β6质粒过表达的GES-1细胞和整合素ανβ6高表达的胃癌AGS细胞中分别加入ERK抑制剂PD98059,通过western blot检测ERK的表达,以检验ERK的干扰效果,为进行后续实验做准备。2.采用逆转录PCR技术,分别检测β6质粒过表达的GES-1细胞和整合素ανβ6高表达的胃癌AGS细胞干扰ERK的表达前后MMP-9在mRNA水平的表达。3.采用ELISA的方法,分别检测β6质粒过表达的GES-1细胞和整合素αυβ6高表达的胃癌AGS细胞干扰ERK的表达前后MMP-9在蛋白水平的表达。结果1. ERK抑制剂PD98059加入β6质粒过表达的GES-1细胞和整合素αυβ6高表达的胃癌AGS细胞后,经western blot证实,ERK的表达较未加入PD98059组均明显下调,说明这两种细胞中ERK的抑制效果明显,可用于后续研究。2.逆转录PCR检测后发现,ERK抑制剂PD98059加入β6质粒过表达的GES-1细胞和整合素αυβ6高表达的胃癌AGS细胞后,基质金属蛋白酶MMP-9在mRNA水平较未加入PD98059组均明显下调。3. ELISA检测后发现,ERK抑制剂PD98059加入β6质粒过表达的GES-1细胞和整合素αυβ6高表达的胃癌AGS细胞后,基质金属蛋白酶MMP-9的蛋白水平较未加入PD98059组均明显下调。结论本部分实验表明,在β6质粒过表达的GES-1细胞和整合素αυβ6高表达的胃癌AGS细胞中分别加入ERK抑制剂PD98059后,随着ERK表达的明显下调,基质金属蛋白酶MMP-9在mRNA和蛋白水平相较于抑制ERK表达前均明显下调。这说明ERK介导了整合素αυβ6对MMP-9的调控,ERK/MAPK信号通路对整合素αυβ6调控MMP-9进而促进胃癌细胞的恶性生物学行为有重要影响。本部分研究明确了整合素αυβ6胃癌细胞侵袭转移的具体机制,为针对整合素αυβ6相关的胃癌靶向治疗研究提供了方向。