前列腺癌(prostate cancer,PCa)是发生在前列腺上皮的男性生殖系统常见的恶性肿瘤。世界范围内,前列腺癌已是导致男性死亡的第二大癌症诱因。根据病情不同前列腺癌的治疗方式可能采取主动监测、根治性手术治疗、放射治疗、激素治疗和化疗等不同的方法。雄激素阻断治疗是前列腺癌的主要治疗手段之一。这种方法在治疗的初期通常会取得较好的疗效,但是对于已发展雄激素非依赖性晚期前列腺癌无效。目前,化疗几乎是雄激素非依赖性晚期前列腺癌的唯一选择。近年来研究发现,紫杉醇和卡巴他赛等一些化疗药物能够显著地改善前列腺癌患者的生活质量,但是却不能有效地延长患者的生存期。发现新型的尤其是对雄激素非依赖性前列腺癌有显著疗效的化疗药物仍然具有重要意义。这类化合物不但对于揭示前列腺癌从雄激素依赖到雄性激素非依赖性转变的分子病理机制具有重要的理论意义,还能为前列腺癌治疗提供潜在的先导化合物。机体为了维持内环境的稳定,能够通过细胞凋亡主动选择性地杀死无用的细胞以及发生癌变的细胞。在肿瘤发生和发展以及肿瘤抵抗化疗药物的过程中,肿瘤细胞能够通过多种机制来抑制凋亡作用从而得以快速增殖。线粒体在细胞凋亡过程中发挥了至关重要的作用。活性氧(reactive oxygen species,ROS)是在细胞有氧代谢过程中产生的过氧化物和自由基等的总称,细胞通过抗氧化系统能够中和这些活性氧从而保持细胞内的氧化还原平衡,ROS的过量生成能够诱导细胞发生线粒体凋亡。癌细胞与正常细胞相比具有更高的氧化应激水平,据此推测可以以ROS信号通路为靶点,通过适度提高细胞内ROS水平(使肿瘤细胞内ROS水平提高到毒性阈值以上而正常细胞ROS水平仍处于毒性阈值以下)从而诱导癌细胞发生凋亡。最近的研究也证实了一些化合物能够通过适度提高肿瘤细胞内ROS的水平而选择性地杀伤肿瘤细胞。由于前列腺癌细胞较正常细胞也具有较高的ROS水平,因此适度提高前列腺癌细胞ROS水平也可能成为前列腺癌的治疗策略。传统中药有几千年的用药史,一些中药抗肿瘤的有效性已得到充分证实。本研究中,我们分析了400余种中药天然小分子化合物对雄激素非依赖性前列腺癌细胞株DU-145增殖的抑制作用,发现土贝母皂苷甲(Tubeimoside-1,TBMS1)、柴胡皂苷d、异土木香内酯、重楼皂苷VII、贝母素乙、岩白菜素等多种化合物能够以剂量依赖的方式抑制DU-145细胞增殖。其中TBMS1对DU-145细胞的抑制作用最强且IC50值最低,因此本研究利用形态学观察、MTT法、荧光染色、蛋白免疫印迹、流式细胞术等实验方法,结合选择性抑制剂系统地分析了TBMS1对前列腺癌细胞DU-145增殖的抑制作用及相关机制。主要研究结果如下:1.TBMS1在5–100μM范围内能够以剂量依赖的方式抑制雄激素非依赖性前列腺癌细胞DU-145以及PC-3的增殖,IC50值约分别为10μM和20μM。2.TBMS1能够以剂量和时间依赖的方式诱导DU-145以及PC-3细胞凋亡并使细胞周期阻滞在G0/G1。3.TBMS1对细胞周期的阻滞作用是通过上调在细胞周期调控中起关键作用的p53蛋白以及其下游的p21蛋白的表达,并进一步影响细胞周期从G1期向S期过渡的关键蛋白Cyclin E和CDK2的表达下调这一过程来实现。4.Caspase抑制剂Z-VAD-FMK能够部分抑制凋亡的发生,但是对于细胞周期的阻滞没有影响,表明TBMS1诱导的DU-145细胞凋亡与细胞周期阻滞之间并没有内在的联系。5.TBMS1通过诱导细胞内活性氧的产生,引起凋亡蛋白Bax表达上调,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调,激活Caspase3,降低细胞线粒体膜电位,从而诱导细胞发生线粒体途径的凋亡。6.TBMS1造成细胞的氧化应激激活MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)蛋白家族并造成其下游转录因子p-JNK及p-p38蛋白表达的上调。TBMS1通过诱导MAPK家族成员ASK-1(凋亡信号调节激酶1)蛋白的磷酸化,引起下游蛋白p-JNK及p-p38表达上调,进而通过影响Bcl-2、Bax的表达以及cleaved-Caspase3的产生,从而诱导前列腺癌细胞发生氧化应激介导的细胞线粒体凋亡。7.TBMS1能够通过影响内质网(ER)应激反应的诱导转录因子CHOP表达的上调,造成内质网应激,从而诱导前列腺癌细胞发生ER应激介导的凋亡。8.ROS抑制剂NAC、p38抑制剂SB203580、JNK抑制剂SP600125、ER应激抑制剂Salubrinal处理细胞后,能够显著抑制TBMS1诱导细胞发生凋亡,进一步证明TBMS1通过氧化应激反应诱导细胞发生线粒体途径的凋亡。综上所述,本研究首次发现TBMS1能够显著抑制雄激素非依赖性前列腺癌DU-145以及PC-3细胞的增殖并通过氧化应激反应介导癌细胞凋亡的发生。