论文部分内容阅读
目的:研究肼酞嗪和丙戊酸联用对他莫昔芬（tamoxifen,TAM）抗性乳腺癌细胞功能、DNA甲基化及基因表达的影响,为肼酞嗪和丙戊酸的临床应用提供数据支持。方法:通过WST-1增殖实验、划痕实验、Transwell侵袭实验、酶联免疫吸附测定（ELISA）法以及流式细胞术,研究肼酞嗪和丙戊酸联用对TAM抗性乳腺癌细胞—LCC2细胞增殖、迁移、侵袭以及凋亡的影响。应用850K甲基化芯片（Infinium MethylationEPIC BeadChip）以及高通量RNA测序（RNA-seq）进行全基因组甲基化和基因表达的检测。使用EXCEL2016和IBM SPSS 24.0统计软件对细胞实验数据以及甲基化水平进行差异分析;使用R3.5.2以及在线分析软件进行差异甲基化位点染色体分布、聚类分析、火山图、基因本体论（Gene Ontology,GO）分析以及京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集分析;使用χ2检验进行甲基化和基因表达的关联分析;使用Kaplan-Meier plotter在线数据库进行生存分析。以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1、肼酞嗪和丙戊酸联用对TAM抗性乳腺癌细胞功能的影响细胞增殖实验结果显示,5μM肼酞嗪和0.5mM丙戊酸联合处理LCC2细胞5天时平均活细胞数（OD）为0.483±0.005,对LCC2细胞增殖的抑制率约为40%,10μM肼酞嗪和1mM丙戊酸联用平均OD为0.537±0.014,对LCC2细胞增殖的抑制率约为33%,低剂量联用组作用效果好于高剂量联用组,差异具有统计学意义（P=0.001）;细胞划痕实验结果显示,划痕后24h时,联合用药组空白处的面积(874265.667±51858.378 pixel^2)与未用药组(627290.667±83950.209 pixel^2)比较,差异具有统计学意义（P=0.012）;Transwell侵袭实验结果显示,未用药组穿过侵袭小室的细胞数量是联合用药组的2.6倍,差异具有统计学意义（P<0.001）;ELISA法检测细胞凋亡结果显示,联合用药组细胞的凋亡水平是未用药组的2.4倍,差异具有统计学意义（P=0.002）,流式细胞术检测细胞凋亡结果显示虽然联合用药组与未用药组细胞凋亡水平差异不具有统计学意义（P>0.05）,但联合用药组的细胞凋亡水平是未用药组的1.5倍;肼酞嗪、丙戊酸以及TAM联合使用时平均OD为0.345±0.014,对LCC2细胞的增殖抑制率约为57%,与未用药组（0.807±0.046）、单独使用TAM组（0.776±0.042）以及肼酞嗪和丙戊酸联用组（0.565±0.016）OD值进行比较差异均具有统计学意义（P<0.001）。2、肼酞嗪和丙戊酸联用对TAM抗性乳腺癌细胞全基因组甲基化的影响联合用药组与未用药组比较,共筛选出28573个差异甲基化位点,其中有1759个位点甲基化水平增高,占全部差异甲基化位点的6.16%,有26814个位点甲基化水平下降,占全部差异甲基化位点的93.84%;发生甲基化改变的基因共9969个,其中甲基化水平下降的基因共9148个,占91.76%,甲基化水平增高的基因有821个,占8.24%;近端启动子区（TSS200、TSS1500和5’UTR）发生甲基化改变的基因共5329个,占53.46%;全基因组甲基化改变基因GO分析结果显示甲基化改变基因参与的功能包括:磷酸化的负调节、细胞-细胞粘附的调节以及激素分泌的调节等,KEGG分析结果显示甲基化改变基因参与的通路包括:MAPK信号通路、雌激素信号通路以及破骨细胞分化等。3、肼酞嗪和丙戊酸联用对TAM抗性乳腺癌细胞全基因组基因表达的影响联合用药组与未用药组比较,共有4386个差异表达基因,其中2091个基因表达水平增高,占47.67%,2295个基因表达水平下降,占52.33%,GO分析结果显示差异表达基因参与的功能有:粘附连接、细胞内信号传导的负调节以及激素水平的调节等,KEGG分析结果显示差异表达基因参与的通路有FoxO信号通路、p53信号通路以及凋亡等。4、全基因组甲基化与基因表达关联分析对既发生甲基化水平改变又发生表达水平改变的1616个基因进行关联分析,在117个甲基化水平增高的基因中表达水平下降的基因有69个,在1499个甲基化水平下降的基因中表达水平增高的基因有776个,分析结果显示关联具有统计学意义（χ2=5.01,P=0.03）;对853个近端启动子区既发生甲基化水平改变又发生表达水平改变的基因进行关联分析,在67个甲基化水平增高的基因中表达水平下降的基因有42个,在786个甲基化水平下降的基因中表达水平增高的基因有398个,分析结果显示关联具有统计学意义（χ2=4.38,P=0.04）;对甲基化水平下降且表达水平增高的776个基因进行GO和KEGG分析,结果显示这些基因参与的功能包括:粘附连接、磷酸化的负调节以及细胞内信号传导的负调节等,参与的主要通路有MAPK信号通路、破骨细胞分化以及TNF信号通路等。5、部分甲基化水平下降且表达水平增高的基因对乳腺癌患者预后的影响利用Kaplan-Meier plotter在线数据库分析TRIM29、TP53INP1、ABAT、SOCS3以及PTPRR对ER阳性且使用TAM治疗的乳腺癌患者预后的影响,结果显示:在ER阳性且使用TAM治疗的乳腺癌患者中,TRIM29高表达组患者的五年无远处转移生存（Distance metastasis free survival,DMFS）（HR=0.49,95%CI:0.29–0.85,P=0.009）时间比低表达组长;ABAT高表达组患者的五年无复发生存（Recurrence-free survival,RFS）（HR=0.67,95%CI:0.47–0.97,P=0.033）时间比低表达组长;SOCS3高表达组患者的五年总生存（Overall survival,OS）（HR=0.32,95%CI:0.13–0.8,P=0.011）时间比低表达组长;TP53INP1以及PTPRR的表达水平与患者预后无关。结论:1、肼酞嗪和丙戊酸联用对TAM抗性乳腺癌细胞的增殖、迁移以及侵袭能力有抑制作用,对凋亡有促进作用,并增强了TAM抗性乳腺癌细胞对TAM的敏感性。2、肼酞嗪和丙戊酸联用降低了TAM抗性乳腺癌细胞的全基因组甲基化水平,且近端启动子区甲基化改变的基因占全部甲基化改变基因的半数以上;肼酞嗪和丙戊酸联用后甲基化水平的下降或增高与基因表达水平的增高或下降之间存在关联。3、肼酞嗪和丙戊酸联用后甲基化水平下降且表达水平增高的基因参与了细胞的粘附连接、磷酸化的负调节以及细胞内信号传导的负调节等功能,参与了MAPK信号通路、破骨细胞分化以及TNF信号通路等。4、在ER阳性且使用TAM治疗的乳腺癌患者中,TRIM29、ABAT以及SOCS3的表达水平越高,预后越好。