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第一部分乳腺癌细胞表达的Fas通过调控肿瘤相关炎症促进肿瘤生长和转移
近年来，Fas分子介导的非凋亡功能越来越受到关注，研究证实肿瘤细胞中表达的Fas具有促进肿瘤生长的功能，但是其具体机制尤其是在肿瘤微环境中如何发挥作用包括如何调控微环境中免疫细胞的功能还不清楚。我们通过Fas信号激活型抗体Jo2刺激小鼠乳腺癌细胞4T1，发现Jo2不能诱导4T1细胞发生凋亡。在4T1细胞中过表达野生型Fas及缺失胞内结构域的Fas，分别构建稳定表达株Fas/WT和Fas/DN，发现Fas/WT和Fas/DN在体外均不影响4T1细胞增殖。然而将上述稳定表达细胞株通过原位移植的方法给BALB/c雌性小鼠荷瘤后，Fas/DN荷瘤小鼠的肿瘤显著变小且小鼠存活时间延长。利用稳定表达shRNA沉默Fas表达的4T1细胞荷瘤BALB/c雌性小鼠，发现沉默Fas的4T1肿瘤生长显著受到抑制，并且存活时间增加。说明肿瘤细胞表达的Fas可能在调控肿瘤微环境中发挥重要作用，但机制如何需要进一步研究。
肿瘤炎性微环境中的各种免疫细胞群体在肿瘤的发生发展中扮演关键的角色，例如肿瘤中大量聚集的髓系来源抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)可强烈抑制T细胞活化，促进肿瘤生长和转移。为了揭示乳腺癌高表达Fas在体内促进乳腺癌生长和调控肿瘤炎性微环境的机制，我们利用流式细胞术检测了4T1，4T1/Fas-WT，4T1/Fas-DN原位移植荷瘤小鼠外周血、脾脏、肿瘤组织中MDSCs、CD4+和CD8+T淋巴细胞比例的变化，发现4T1/Fas-DN荷瘤小鼠中外周血、脾脏、肿瘤组织中MDSCs显著减少，CD4+和CD8+T细胞数量增加。免疫组织化学染色也表明4T1/Fas-DN荷瘤小鼠肿瘤组织中MDSCs明显减少。接着用稳定表达shRNA沉默Fas的4T1细胞(4T1/Fas shRNA)和阴性对照4T1细胞(4T1/NC)荷瘤小鼠，发现4T1/FasshRNA荷瘤小鼠肝脏、肺、引流淋巴结、肿瘤组织中的MDSCs显著减少。
为了研究乳腺癌组织中MDSCs是如何被高表达Fas的乳腺癌细胞招募过来的，利用ELISA检测了Jo2刺激4T1、4T1/FasWT、4T1/FasDN细胞0h、12h、24h、36h后的培养上清中IL-6、G-CSF、M-CSF、VEGF、MCP-1、CXCL2、CXCL1、TNF-?、IL-1β、PGE2的含量，发现4T1/FasDN细胞上清中IL-6、PGE2的含量显著降低而其它细胞因子的变化不显著。已知活化的NF-κB、MAPK信号通路可诱导IL-6、PGE2产生，为了研究IL-6、PGE2如何被活化的Fas信号诱导，我们先检测了Fas信号通路是否能活化NF-κB、MAPK信号。利用WesternBlot检测了Jo2刺激4T1细胞后磷酸化ERK、P38、JNK以及核内p65水平的变化，发现随着Jo2刺激时间的增加磷酸化p38、ERK及核内p65的水平都增加而JNK的磷酸化水平没有变化。用P38、ERK、NF-κB抑制剂抑制相应通路后，再用Jo2刺激4T1细胞，发现P38抑制剂显著降低IL-6和PGE2产生，NF-κB的抑制剂只能抑制PGE2的产生而ERK的抑制剂不能抑制IL-6、PGE2的产生。通过每天一次，连续14天向4T1荷瘤小鼠腹腔注射IL-6中和抗体及COX2抑制剂SC58125，发现注射IL-6中和抗体小鼠体内肿瘤组织中MDSCs显著减少而外周血及脾脏中MDSCs没有显著变化。但在注射COX2抑制剂的荷瘤小鼠中肿瘤组织、外周血、脾脏中的MDSCs数量均显著减少并且注射IL-6中和抗体和COX2抑制剂的小鼠肿瘤生长显著被抑制。为了证实Fas是否可以作为治疗乳腺癌的靶点，我们利用肿瘤内注射胆固醇修饰的siRNA沉默荷瘤小鼠的4T1肿瘤细胞Fas表达，注射FassiRNA后肿瘤显著减小，并且肝脏、肺、引流淋巴结中的肿瘤转移灶数量亦明显减少。最后通过对乳腺癌病人临床病理数据的统计分析，发现乳腺癌病人Fas的表达与其存活期有显著的负相关性。
综上，我们的研究揭示了乳腺癌细胞的Fas信号活化可以促进肿瘤细胞产生IL-6、PGE2等炎症因子，进而招募大量髓系抑制性细胞MDSCs至肿瘤组织中，从而促进乳腺癌的生长和转移。上述结果为阐明肿瘤炎性微环境中肿瘤免疫逃逸的机制增添了新的认识，阻断Fas信号可阻断肿瘤相关的炎症，有可能为乳腺癌的治疗提供新的思路。
第二部分拓扑异构酶Top2a促进人乳腺癌细胞生长的机制研究
拓扑异构酶(Topoisomerase，Topo)是重要的核酶，能够调节DNA的空间构象。拓扑异构酶Ⅱ?(TopoisomeraseⅡ,Top2a)是近年来发现的一个新型的肿瘤生物标志物，研究证实Top2a基因在某些类型肿瘤中高表达，包括乳腺癌、肺癌、肝癌、结直肠癌等。Top2a与表皮生长因子HER-2在乳腺癌中的表达有一定的相关性。目前认为，Top2a在乳腺癌、肺癌以及前列腺癌中可以作为预后的一个指标，而且是乳腺癌抗癌药物的靶点，然而Top2a在乳腺癌中的高表达到底如何促进肿瘤的生长，其具体的分子机制并不清楚。在本研究中我们拟探讨Top2a调控乳腺癌发生和发展的机制，以期为乳腺癌的发病机制提供新的认识。
我们检测了多种乳腺癌细胞系中Top2a蛋白水平的表达，发现乳腺癌细胞系MCF-7，MDA-MB-231中均有高表达。利用体外转染siRNA沉默MCF-7以及MDA-MB-231乳腺癌细胞中Top2a的表达，WST-8法检测肿瘤细胞生长结果表明，沉默Top2a后乳腺癌细胞的增殖显著受到抑制。接着在MCF-7乳腺癌细胞中稳定表达shRNA沉默Top2a后，再通过外源性过表达Top2a，恢复MCF-7中Top2a的水平，检测其在体外的细胞增殖，结果表明沉默Top2a的细胞恢复Top2a的表达后可以逆转因Top2a沉默引起的对细胞增殖的抑制作用。通过BALB/c裸鼠的MCF-7细胞的体内移植肿瘤模型，利用Doxycyclin诱导瘤内肿瘤细胞沉默Top2a，表明沉默Top2a后，MCF-7乳腺癌细胞在体内的生长被非常显著地抑制。利用免疫组织化学的方法检测肿瘤组织中肿瘤细胞Ki67的表达，发现沉默Top2a后肿瘤组织中MCF-7乳腺癌细胞Ki67的表达显著减少，说明Top2a是通过影响肿瘤细胞的增殖而调控肿瘤的生长。
为了研究Top2a如何调控乳腺癌细胞增殖，利用体外转染siRNA沉默MCF-7以及MDA-MB-231乳腺癌细胞中Top2a的表达，转染48h后检测细胞凋亡的变化，结果表明Top2a在MCF-7以及MDA-MB-231乳腺癌细胞中表达的下降不能引起细胞凋亡。用siRNA沉默MCF-7和MDA-MB-231细胞中Top2a的表达后，检测了其细胞周期，发现Top2a在MCF-7乳腺癌细胞中表达下降后，可以使S期的细胞增加，而在G2/M期细胞减少，然而Top2a在MDA-MB-231乳腺癌细胞中表达下降后，处在G2/M期的细胞增加，而处在G0/G1期的细胞减少，提示Top2a调控乳腺癌细胞的周期。接下来，我们利用Cas9技术在MCF-7乳腺癌细胞中敲除Top2a的表达，并利用Affymetrix全基因组表达谱芯片检测了敲除Top2a的MCF-7乳腺癌细胞中基因表达的变化，芯片结果显示细胞周期蛋白CyclinA1表达显著降低。通过Q-PCR的方法在敲除Top2a的MCF-7以及MDA-MB-231乳腺癌细胞中证实了敲除Top2a后，MCF-7以及MDA-MB-231乳腺癌细胞中cyclinA1的mRNA表达水平显著下降，WesternBlot实验证明Top2a敲除后，MCF-7以及MDA-MB-231乳腺癌细胞中cyclinA1的蛋白水平也明显下降，表明周期蛋白cyclinA1可能是介导Top2a发挥对细胞周期调控作用的重要分子，但后续的分子机制还在进一步研究之中。
综上，我们研究结果表明Top2a可能通过周期蛋白CyclinA1调控乳腺癌细胞周期的方式，在乳腺癌的发生发展中起到重要作用，但其具体的机制还有待于阐明。上述结果可为揭示Top2a在调控乳腺癌发生发展中的机制提供新的认识，并可能为靶向Top2a的乳腺癌治疗提供依据和思路。
近年来，Fas分子介导的非凋亡功能越来越受到关注，研究证实肿瘤细胞中表达的Fas具有促进肿瘤生长的功能，但是其具体机制尤其是在肿瘤微环境中如何发挥作用包括如何调控微环境中免疫细胞的功能还不清楚。我们通过Fas信号激活型抗体Jo2刺激小鼠乳腺癌细胞4T1，发现Jo2不能诱导4T1细胞发生凋亡。在4T1细胞中过表达野生型Fas及缺失胞内结构域的Fas，分别构建稳定表达株Fas/WT和Fas/DN，发现Fas/WT和Fas/DN在体外均不影响4T1细胞增殖。然而将上述稳定表达细胞株通过原位移植的方法给BALB/c雌性小鼠荷瘤后，Fas/DN荷瘤小鼠的肿瘤显著变小且小鼠存活时间延长。利用稳定表达shRNA沉默Fas表达的4T1细胞荷瘤BALB/c雌性小鼠，发现沉默Fas的4T1肿瘤生长显著受到抑制，并且存活时间增加。说明肿瘤细胞表达的Fas可能在调控肿瘤微环境中发挥重要作用，但机制如何需要进一步研究。
肿瘤炎性微环境中的各种免疫细胞群体在肿瘤的发生发展中扮演关键的角色，例如肿瘤中大量聚集的髓系来源抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)可强烈抑制T细胞活化，促进肿瘤生长和转移。为了揭示乳腺癌高表达Fas在体内促进乳腺癌生长和调控肿瘤炎性微环境的机制，我们利用流式细胞术检测了4T1，4T1/Fas-WT，4T1/Fas-DN原位移植荷瘤小鼠外周血、脾脏、肿瘤组织中MDSCs、CD4+和CD8+T淋巴细胞比例的变化，发现4T1/Fas-DN荷瘤小鼠中外周血、脾脏、肿瘤组织中MDSCs显著减少，CD4+和CD8+T细胞数量增加。免疫组织化学染色也表明4T1/Fas-DN荷瘤小鼠肿瘤组织中MDSCs明显减少。接着用稳定表达shRNA沉默Fas的4T1细胞(4T1/Fas shRNA)和阴性对照4T1细胞(4T1/NC)荷瘤小鼠，发现4T1/FasshRNA荷瘤小鼠肝脏、肺、引流淋巴结、肿瘤组织中的MDSCs显著减少。
为了研究乳腺癌组织中MDSCs是如何被高表达Fas的乳腺癌细胞招募过来的，利用ELISA检测了Jo2刺激4T1、4T1/FasWT、4T1/FasDN细胞0h、12h、24h、36h后的培养上清中IL-6、G-CSF、M-CSF、VEGF、MCP-1、CXCL2、CXCL1、TNF-?、IL-1β、PGE2的含量，发现4T1/FasDN细胞上清中IL-6、PGE2的含量显著降低而其它细胞因子的变化不显著。已知活化的NF-κB、MAPK信号通路可诱导IL-6、PGE2产生，为了研究IL-6、PGE2如何被活化的Fas信号诱导，我们先检测了Fas信号通路是否能活化NF-κB、MAPK信号。利用WesternBlot检测了Jo2刺激4T1细胞后磷酸化ERK、P38、JNK以及核内p65水平的变化，发现随着Jo2刺激时间的增加磷酸化p38、ERK及核内p65的水平都增加而JNK的磷酸化水平没有变化。用P38、ERK、NF-κB抑制剂抑制相应通路后，再用Jo2刺激4T1细胞，发现P38抑制剂显著降低IL-6和PGE2产生，NF-κB的抑制剂只能抑制PGE2的产生而ERK的抑制剂不能抑制IL-6、PGE2的产生。通过每天一次，连续14天向4T1荷瘤小鼠腹腔注射IL-6中和抗体及COX2抑制剂SC58125，发现注射IL-6中和抗体小鼠体内肿瘤组织中MDSCs显著减少而外周血及脾脏中MDSCs没有显著变化。但在注射COX2抑制剂的荷瘤小鼠中肿瘤组织、外周血、脾脏中的MDSCs数量均显著减少并且注射IL-6中和抗体和COX2抑制剂的小鼠肿瘤生长显著被抑制。为了证实Fas是否可以作为治疗乳腺癌的靶点，我们利用肿瘤内注射胆固醇修饰的siRNA沉默荷瘤小鼠的4T1肿瘤细胞Fas表达，注射FassiRNA后肿瘤显著减小，并且肝脏、肺、引流淋巴结中的肿瘤转移灶数量亦明显减少。最后通过对乳腺癌病人临床病理数据的统计分析，发现乳腺癌病人Fas的表达与其存活期有显著的负相关性。
综上，我们的研究揭示了乳腺癌细胞的Fas信号活化可以促进肿瘤细胞产生IL-6、PGE2等炎症因子，进而招募大量髓系抑制性细胞MDSCs至肿瘤组织中，从而促进乳腺癌的生长和转移。上述结果为阐明肿瘤炎性微环境中肿瘤免疫逃逸的机制增添了新的认识，阻断Fas信号可阻断肿瘤相关的炎症，有可能为乳腺癌的治疗提供新的思路。
第二部分拓扑异构酶Top2a促进人乳腺癌细胞生长的机制研究
拓扑异构酶(Topoisomerase，Topo)是重要的核酶，能够调节DNA的空间构象。拓扑异构酶Ⅱ?(TopoisomeraseⅡ,Top2a)是近年来发现的一个新型的肿瘤生物标志物，研究证实Top2a基因在某些类型肿瘤中高表达，包括乳腺癌、肺癌、肝癌、结直肠癌等。Top2a与表皮生长因子HER-2在乳腺癌中的表达有一定的相关性。目前认为，Top2a在乳腺癌、肺癌以及前列腺癌中可以作为预后的一个指标，而且是乳腺癌抗癌药物的靶点，然而Top2a在乳腺癌中的高表达到底如何促进肿瘤的生长，其具体的分子机制并不清楚。在本研究中我们拟探讨Top2a调控乳腺癌发生和发展的机制，以期为乳腺癌的发病机制提供新的认识。
我们检测了多种乳腺癌细胞系中Top2a蛋白水平的表达，发现乳腺癌细胞系MCF-7，MDA-MB-231中均有高表达。利用体外转染siRNA沉默MCF-7以及MDA-MB-231乳腺癌细胞中Top2a的表达，WST-8法检测肿瘤细胞生长结果表明，沉默Top2a后乳腺癌细胞的增殖显著受到抑制。接着在MCF-7乳腺癌细胞中稳定表达shRNA沉默Top2a后，再通过外源性过表达Top2a，恢复MCF-7中Top2a的水平，检测其在体外的细胞增殖，结果表明沉默Top2a的细胞恢复Top2a的表达后可以逆转因Top2a沉默引起的对细胞增殖的抑制作用。通过BALB/c裸鼠的MCF-7细胞的体内移植肿瘤模型，利用Doxycyclin诱导瘤内肿瘤细胞沉默Top2a，表明沉默Top2a后，MCF-7乳腺癌细胞在体内的生长被非常显著地抑制。利用免疫组织化学的方法检测肿瘤组织中肿瘤细胞Ki67的表达，发现沉默Top2a后肿瘤组织中MCF-7乳腺癌细胞Ki67的表达显著减少，说明Top2a是通过影响肿瘤细胞的增殖而调控肿瘤的生长。
为了研究Top2a如何调控乳腺癌细胞增殖，利用体外转染siRNA沉默MCF-7以及MDA-MB-231乳腺癌细胞中Top2a的表达，转染48h后检测细胞凋亡的变化，结果表明Top2a在MCF-7以及MDA-MB-231乳腺癌细胞中表达的下降不能引起细胞凋亡。用siRNA沉默MCF-7和MDA-MB-231细胞中Top2a的表达后，检测了其细胞周期，发现Top2a在MCF-7乳腺癌细胞中表达下降后，可以使S期的细胞增加，而在G2/M期细胞减少，然而Top2a在MDA-MB-231乳腺癌细胞中表达下降后，处在G2/M期的细胞增加，而处在G0/G1期的细胞减少，提示Top2a调控乳腺癌细胞的周期。接下来，我们利用Cas9技术在MCF-7乳腺癌细胞中敲除Top2a的表达，并利用Affymetrix全基因组表达谱芯片检测了敲除Top2a的MCF-7乳腺癌细胞中基因表达的变化，芯片结果显示细胞周期蛋白CyclinA1表达显著降低。通过Q-PCR的方法在敲除Top2a的MCF-7以及MDA-MB-231乳腺癌细胞中证实了敲除Top2a后，MCF-7以及MDA-MB-231乳腺癌细胞中cyclinA1的mRNA表达水平显著下降，WesternBlot实验证明Top2a敲除后，MCF-7以及MDA-MB-231乳腺癌细胞中cyclinA1的蛋白水平也明显下降，表明周期蛋白cyclinA1可能是介导Top2a发挥对细胞周期调控作用的重要分子，但后续的分子机制还在进一步研究之中。
综上，我们研究结果表明Top2a可能通过周期蛋白CyclinA1调控乳腺癌细胞周期的方式，在乳腺癌的发生发展中起到重要作用，但其具体的机制还有待于阐明。上述结果可为揭示Top2a在调控乳腺癌发生发展中的机制提供新的认识，并可能为靶向Top2a的乳腺癌治疗提供依据和思路。