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模式识别受体在抗感染免疫应答中发挥重要作用。NLRP3（NACHT,LRR and PYD domains-containing protein 3）受体和MDA5（Melanoma differentiation associated gene 5）分别为NOD样受体家族（Nucleotide-binding oligomerization domain like receptors）和RIG样受体家族（Retinoicacid inducible gene I like receptors）中的重要成员,可被病毒RNA激活,介导NF-κB信号通路引起下游免疫因子的成熟、释放,参与胞内免疫应答反应。相比哺乳动物,有关禽类NLRP3和MDA5分子特征和调控机制尚不清楚。本文分别对NLRP3（chNLRP3）和鸡MDA5（chMDA5）受体基因进行克隆、表达并制备出相应抗体,为进一步探究其参与天然抗病毒免疫应答的作用机制奠定基础。首先,通过设计特异性引物分别以RT-PCR扩增chNLRP3和SOE-PCR扩增chMDA5受体基因CDS序列,与pEASY-Blunt克隆载体连接、转化E.coli DH5α菌,经菌液PCR和双酶切鉴定,将阳性克隆进行基因测序并分析其同源性。结果显示,我们克隆出chNLRP3和chMDA5受体基因,大小分别为2205bp和3306bp;成功构建了pEASY-Blunt-chNLRP3和pEASY-Blunt-chMDA5克隆重组质粒;对chNLRP3及chMDA5氨基酸推导序列与已知物种的相应序列比对后发现,本实验室获得chNLRP3推导氨基酸序列与黄羽肉鸡NLRP3（KF318520）同源性最高,为95.2%。与鱼（XM01504447）同源性最低,仅为4.8%,且不在同一分支,相对亲缘关系较远。chMDA5氨基酸推导序列较原鸡（AB371640）同源性较高,为97.2%,与草鱼（JN986720）的同源性为42.1%,同样不在同一分支,相对亲缘关系较远。其次,通过DNAStar软件对chNLRP3和chMDA5受体的抗原表位进行预测,选取抗原表位较为集中的N端氨基酸片段（chNLRP3第1-200位氨基酸,chMDA5第1-255位氨基酸）,设计相应PCR扩展引物,以pEASY-Blunt-chNLRP3和pEASY-Blunt-chMDA5重组质粒为模板,扩增目的片段,分别插入pET-32a原核表达载体,经IPTG诱导重组蛋白表达并纯化,分别免疫家兔制备抗血清并经ELISA和western blot方法鉴定。结果表明,通过PCR扩增出chNLRP3和chMDA5截短基因片段,大小分别为600bp和765bp,构建出pET-32a/chNLRP3和pET-32a/MDA5原核表达重组质粒,获得纯化的融合蛋白免疫新西兰兔,制备出兔抗His/chNLRP3（1-200aa）和His/MDA5（1-255aa）融合蛋白多克隆抗体,经ELISA和western blot检测结果表明,所获的2种抗体均可与相应免疫原发生特异性结合。最后,分别亚克隆chNLRP3和chMDA5受体基因至pmCherry-N1和pEGFP-N1真核表达质粒,将两种质粒分别通过脂质体（Lipofectamine）3000瞬时转染DF-1细胞,培养48h后在倒置荧光显微镜下观察融合蛋白表达情况。裂解细胞,通过SDS-PAGE电泳后,通过相应抗体进行Western blot检测chNLRP3和chMDA5融合蛋白表达情况。结果表明,我们构建出真核表达重组质粒chNLRP3/Cherry-N1和chMDA5/GFP-N1,将其转染DF-1细胞后,通过显微荧光观察和western blot方法能检测到过表达NLRP3和MDA5融合蛋白。以所制备的抗体能够检测到相应与理论蛋白分子量一致的融合蛋白,大小分别为108.6kDa和137.2kDa。综上所述,本研究克隆了鸡NLRP3和MDA5基因,并构建出相应原核表达重组质粒,经诱导表达,蛋白纯化及免疫新西兰兔,制备出相应兔抗chNLRP3和chMDA5多克隆抗体;构建chNLRP3和chMDA5真核表达重组质粒并成功转染DF-1细胞,通过荧光观察和western blot方法可检测到细胞内过表达chNLRP3和chMDA5受体蛋白。上述结果为进一步研究chNLRP3和chMDA5受体在病原体识别和免疫应答中启动的相关机制奠定基础。