【摘 要】
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目的:本实验拟研究敲除HSC-T6中的COX-2后细胞自噬水平改变及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达变化,探讨COX-2与HSC-T6自噬的关系,明确COX-2是否通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控HSC-T6自噬,以期为LF的防治提供新思路。方法:1、体外培养HSC-T6,分为control组（对照组,HSC-T6未做任何处理）、NC组（空载体组,LV-NC-sg RNA转
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（编号81373465）； 湖南省科技厅临床医疗技术创新引导项目（编号2018SK51707）；
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目的:本实验拟研究敲除HSC-T6中的COX-2后细胞自噬水平改变及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达变化,探讨COX-2与HSC-T6自噬的关系,明确COX-2是否通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控HSC-T6自噬,以期为LF的防治提供新思路。方法:1、体外培养HSC-T6,分为control组（对照组,HSC-T6未做任何处理）、NC组（空载体组,LV-NC-sg RNA转染HSC-T6）、KO组（敲除组,LV-COX-2-sg RNA转染HSC-T6）,使用荧光显微镜观察转染效率、Western blot检测COX-2蛋白表达情况。2、利用自噬诱导剂Rapamycin及过表达病毒处理细胞,分为control组（HSC-T6未行任何处理）、Rap组（HSC-T6加入Rapamycin）、Rap+OE-NC组（HSC-T6加入Rapamycin及过表达空载体病毒Lv-NC-oe）、Rap+OE-COX-2组（HSC-T6加入Rapamycin及过表达COX-2病毒Lv-COX-2-oe）、NC组（HSC-T6 sg RNA-NC稳筛细胞未行任何处理）、KO组（HSC-T6 sg RNA-COX-2稳筛细胞未行任何处理）。应用免疫荧光检测观察LC3表达情况、Western blot检测LC3Ⅱ/Ⅰ、p-mTOR表达情况。3、使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）处理细胞,分为control组（HSC-T6未行任何处理）、KO组（HSC-T6 sg RNA-COX-2稳筛细胞未行任何处理）、3-MA组（HSC-T6加入3-MA）、KO+3-MA组（HSC-T6 sg RNA-COX-2稳筛细胞加入3-MA）,使用MDC染色检测自噬体的形成情况、Western blot检测LC3Ⅱ/Ⅰ表达情况。4、利用PI3K抑制剂LY294002、Akt抑制剂Perifosine处理细胞,分为control组（HSC-T6未行任何处理）、KO组（HSC-T6sg RNA-COX-2稳筛细胞未行任何处理）、LY294002组（HSC-T6加入10μM LY294002）、KO+LY294002组（HSC-T6 sg RNA-COX-2稳筛细胞加入10μM LY294002）、Perifosine组（HSC-T6加入25μM Perifosine）、KO+Perifosine组（HSC-T6 sg RNA-COX-2稳筛细胞加入25μM Perifosine）,使用Western blot检测LC3Ⅱ/Ⅰ、pmTOR/mTOR、p-Akt/Akt表达情况。结果:1、COX-2-sg RNA慢病毒载体转染HSC-T6后细胞COX-2表达量明显下降,差异具有统计学意义（P＜0.05）。2、与control组相比,Rap组及KO组p-mTOR/mTOR的表达水平下降,而LC3的表达水平上升;与Rap组相比,加入COX-2过表达病毒之后p-mTOR/mTOR的表达水平上升,LC3的表达水平下降,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。3、与control组相比,3-MA组LC3表达水平下降,自噬体减少,KO组LC3表达水平上升,自噬体增多,与KO组相比,KO+3-MA组LC3表达水平下降,自噬体减少,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。4、与control组相比,KO组、LY294002组及Perifosine组pmTOR和p-Akt的表达水平均下降,而LC3的表达水平上升;与KO组相比,KO+LY294002组及KO+Perifosine组p-mTOR和p-Akt的表达水平均下降,而LC3的表达水平上升,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论:敲除HSC-T6中的COX-2后,HSC-T6自噬水平增高,COX-2通过PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制HSC-T6自噬。
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