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根据病毒表面血凝素(HA)与神经氨酸酶(NA),禽流感病毒(AIV)可分为16个HA以及9个NA亚型。根据AIV致病能力的不同,又可分为低致病性禽流感(LPAI)和高致病性禽流感(HPAI)。虽然AIV疫苗的使用,有效限制了国内AIV的扩散及其大流行,每年AIV感染及发病给家禽业仍旧带来巨大经济损失。值得注意的是,近年来越来越多的AIV可分离于免疫鸡群。与免疫毒株比较,这些免疫逃逸株AIV往往具有抗原性改变的HA以及NA蛋白。如何快速高通量对这些抗原变异AIV的检测对当前国内AIV防控至关重要。与易变异的HA以及NA蛋白不同,流感病毒NP蛋白相对保守。因此,NP能作为检测免疫逃逸株AIV的有效靶点。本研究以H9N2禽流感病毒免疫小鼠,以转染NP真核表达质粒的DF1细胞为筛选原,在获得抗NP蛋白单克隆抗体的基础上,构建了基于NP蛋白的特异、高灵敏检测禽流感病毒的双夹心ELISA。1、抗禽流感病毒NP蛋白的单克隆抗体的研制及特性为制备抗禽流感病毒NP蛋白的单克隆抗体,本研究将H9N2禽流感病毒免疫小鼠,以转染NP真核表达质粒的DF1细胞为筛选原,通过间接免疫荧光(IFA)筛选到2个阳性杂交瘤细胞株,命名为NP-2F10和NP-4A7。在IFA试验中,单抗NP-2F10和NP-4A7均能与感染H9N2病毒的MDCK以及转染NP真核表达质粒的DF1细胞发生亮绿色荧光。NP-2F10和NP-4A7的IFA效价分别为1:6400以及1:12800。值得注意的是,单抗NP-2F10和NP-4A7不仅能通过Western blot识别转染NP真核表达质粒的MDCK细胞或H9N2病毒中变性的线性化的NP蛋白,而且能通过免疫共沉淀捕获感染H9N2病毒的MDCK细胞中非变性的天然的NP蛋白。以上2个抗流感病毒NP单克隆抗体的获得为构建基于NP蛋白的检测流感病毒的双夹心ELISA提供了材料,打下了基础。2、基于NP蛋白的检测禽流感病毒双夹心ELISA方法的初步建立为建立快速高灵敏性的检测禽流感病毒的诊断技术,本研究将以上获得的2株抗NP蛋白的单抗NP-2F10和NP-4A7进行了纯化、酶标,构建了检测流感病毒的双夹心ELISA。在ELISA中,单抗NP-2F10为包被捕获抗体(浓度2ug/mL),HPR标记的NP-4A7为检测用抗体(稀释度1:16000)。特异性试验证明所建立的双抗体夹心ELISA能与所检测的H1N1,H3N2以及H9N2反应,而与所检测的血清4型禽腺病毒(FAdV-4)、血清8型禽腺病毒(FAdV-8)、禽白血病毒(ALV)、禽网状内皮组织增生症病毒(REV)、马立克氏病病毒(MDV)以及禽传染性支气管炎病毒(IBV)不反应。灵敏度试验发现,该ELISA最低能检测出5×102个TCID50/mL流感病毒。该ELISA检测灵敏度显著高于血凝试验,是血凝试验的12.5-50倍。对35份临床组织样品的比对检测中发现,该ELISA检测结果与病毒分离结果的符合率为68.6%。因此,以上构建的基于NP蛋白的特异高灵敏的检测禽流感病毒的双夹心ELISA具有一定的应用前景。