研究背景机体在健康状态下,氧化和抗氧化物质保持着精确的平衡。当自由基在体内过度积聚、体内氧化与抗氧化失衡,会造成广泛的综合病症。超氧阴离子作为生物体代谢过程中产生的氧自由基,可以攻击核酸、蛋白、脂质等生物大分子,引起细胞结构和功能的破坏,与机体的组织损伤存在密切联系。由于慢性氧化应激失平衡的表征不易被察觉,所以危害性极大。消化道是机体营养吸收和代谢的主要器官,氧化还原失衡极易诱发胃肠道疾病和消化道紊乱。随着近年肠道氧化应激概念的提出,肠腔内氧自由基逐渐成为肠屏障损伤的关键因素。本研究利用体外肠屏障模型,旨在探究细胞外超氧阴离子破坏肠屏障的机制。方法实验一:利用人结直肠癌细胞系Caco-2在体外构建肠屏障模型。实验分成对照组,超氧阴离子刺激组,恢复组三组。体外屏障构建完成后,对照组给予完全培养基,超氧阴离子刺激组给予产超氧阴离子的细菌和黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶反应体系,恢复组在刺激基础上加入SOD消除超氧阴离子。通过检测细胞单层跨膜电阻值以及对荧光染料FSA的渗透,观察超氧阴离子对屏障完整性和渗透性的影响和细胞间紧密连接蛋白的表达和分布。实验二:胞外超氧阴离子刺激Caco-2细胞,给予SOD干预。利用转录组测序观察超氧阴离子刺激下细胞基因水平的改变。根据胞内主要的信号响应,利用MitoSOX探针检测线粒体超氧阴离子,并观察细胞凋亡信号的改变。结果1、利用人结直肠癌Caco-2细胞系成功构建体外肠上皮屏障模型,在两种不同胞外超氧阴离子刺激下屏障渗透性均显著升高。同时,细胞间紧密连接蛋白ZO-1,Occludin表达下降,Claudin-4,Occludin蛋白断裂分布。加入SOD可有效改善超氧阴离子对肠屏障的损伤。2、转录组测序分析观察到细胞在超氧阴离子刺激后有550个基因上调,351个基因下调。且细胞内氧化应激和凋亡相关基因表达升高,抗氧化基因表达下降。MitoSOX探针检测到线粒体在胞外氧化应激作用下产生大量超氧阴离子,细胞色素C从线粒体释放进入胞质。荧光定量PCR实验证实凋亡相关基因显著上调。SOD淬灭胞外超氧阴离子可降低胞内氧化应激水平,下调凋亡相关基因的表达水平,改善由胞外超氧阴离子引起的胞内氧化应激诱导的细胞凋亡。结论实验探索发现细胞外超氧阴离子刺激会引起体外肠屏障模型结构和功能损伤。胞外氧化应激失衡时,诱导线粒体产生大量超氧阴离子,最终导致凋亡信号升高。通过SOD干预,可以有效降低线粒体的超氧阴离子水平并抑制细胞凋亡过程,最终维护体外肠屏障结构和功能的完整性。