生淀粉糖化酶(简称RSDG)是指可以在低于淀粉的糊化温度下,直接作用于未经高温处理、未糊化的生淀粉晶体颗粒,生成葡萄糖的一种淀粉酶。将其用于淀粉分解过程,可以免去高温处理过程,简化生产工艺,节约大量能源。本研究从腐烂的木薯块根中筛选到一株能够分泌生淀粉糖化酶的菌种,经分子鉴定和形态观察,鉴定该菌种为黑曲霉,命名为AspergillusnigerF-01(简称F-01)。通过紫外线和亚硝基胍诱变,得到高产突变株Aspergillus nigerG-11(简称G-11),在淀粉为碳源的产酶培养基上产酶水平达到77.8U/mL,是F-01产酶水平的3.4倍。为了研究是哪些位点突变导致从F-01到G-11产酶水平的提高,分别克隆了F-01和G-11的生淀粉酶糖化酶基因开放阅读框、启动子以及碳源代谢阻遏因子creA,进行了序列比对,并对F-01和G-11的生淀粉酶糖化酶基因和启动子的功能差异进行了分析。通过序列分析发现,F-01生淀粉糖化酶基因DNA全长2169bp,有4个内含子,cDNA编码区全长1920 bp,共编码639个氨基酸,前18个氨基酸为信号肽序列。G-11生淀粉糖化酶基因DNA全长2172 bp,有4个内含子,cDNA编码区全长1923 bp,编码640个氨基酸,前18个氨基酸为信号肽序列。这两个基因同源性99.86%,区别在于G-11的生淀粉糖化酶基因比F-01多3个碱基(CGG),位于1768-1770 bp,其余序列完全相同;F-01和G-11生淀粉糖化酶基因启动子长度分别是653 bp和615 bp,都含有真核生物启动子区的保守序列,G-11的生淀粉糖化酶基因启动子比F-01的少了一个38 bp的片段,位于415-452 bp之间,其余序列完全相同;F-01和G-11的creA基因序列完全一致,全长1284 bp,该基因没有内含子,共编码427个氨基酸。通过F-01和G-11的生淀粉酶糖化酶基因在Pichia pastoris GS115中进行表达后发现,在相同的表达体系和诱导条件下,表达这两个基因的毕赤酵母产生淀粉糖化酶水平没有差异,这表明,从F-01到G-11生淀粉糖化酶基因编码区的突变不是导致产酶水平提高的原因;通过把F-01和G-11生淀粉糖化酶的启动子构建到载体pRS303k中,转化Escherichia coli JM109,比较其活性,发现该位点突变使启动子的活性增强,因此,启动子区的突变是造成从F-01到G-11生淀粉糖化酶产酶水平提高的原因。分别以木薯淀粉、糊精、麦芽六糖、麦芽糖和葡萄糖为碳源培养F-01和G-11,发现碳源种类影响F-01和G-11的生淀粉糖化酶的合成。越容易被利用的碳源,越不利于产酶,因此可知,这两个菌种的生淀粉糖化酶合成受碳源代谢阻遏调控。通过RNA干扰F-01和G-11的creA得到RNA干扰突变株分别是FR-06和GR-6,弱化了碳源代谢阻遏效应,从而提高了产酶水平。在葡萄糖碳源培养基上F-01的creA干扰菌株FR-06所产的酶活力是F-01的16.2倍,G-11的creA干扰菌株GR-6的酶活力是G-11的11.9倍;在淀粉碳源培养基上,FR-06的酶活力是F-01的11.4倍,GR-6的酶活力是G-11的52倍。发现麦芽糖的结构类似物-麦芽糖酯,可以通过激活生淀粉糖化酶的转录,显著提高菌种F-01和G-11的产酶水平。在葡萄糖为碳源的培养基上,添加8 g/L麦芽糖酯F-01的产酶水平是不添加时的8.1倍,在淀粉为碳源的培养基上,添加5 g/L麦芽糖酯F-01产酶水平是不添加时的8.3倍。在葡萄糖为碳源的培养基上,添加6 g/L麦芽糖酯G-11产酶水平是不添加时的6.1倍。在淀粉为碳源的培养基上,当添加4 g/L麦芽糖酯G-11的产酶水平是不添加时的4.5倍。通过单因素实验、Plackett-Burman实验和响应面分析,优化培养基组分和培养条件,GR-6的产生淀粉糖化酶水平由408U/mL提升到687.3U/mL,该活力远高于目前国内外同类报道中的酶活力水平。通过硫酸铵盐析、DEAE Sepharose FF离子层析和Sephadex G-75凝胶色谱层析,可把GR-6分泌的生淀粉糖化酶纯化45.0倍,收率是6.35%。GR-6生淀粉糖化酶的最适合作用温度是50 ℃,50 ℃以下具有较好的热稳定性,最适合pH是pH6.5,在pH5.0到pH8.0之间稳定性较好,Mn2+、Ca2+和Fe2+对酶有激活作用,而Zn2+和Ni2+对酶活力有明显的抑制作用,酶分子量大约70 kDa,分解生淀粉后只有葡萄糖一种产物,表明该酶是生淀粉糖化酶。将本研究中制备的生淀粉糖化酶用于生料发酵生产酒精实验,发酵72 h,酒精度达到18.10%(v/v),而相同条件下,传统的熟料发酵获得的酒精度是16.22%(v/v),因此,该酶在生料发酵生产酒精工艺中有一定的应用前景。