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黄病毒（Flavivirus）是一类通过吸血节肢动物传播的单股正链RNA病毒,主要包括乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）、寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）、登革病毒（dengue virus,DENV）、西尼罗病毒（West Nile Virus,WNV）等。黄病毒具有明显的神经嗜性,例如JEV和WNV感染都能靶向宿主的中枢神经系统,导致病毒性脑炎;而ZIKV则可通过母婴传播感染胎儿,并导致胎儿先天性寨卡病毒综合征（CZS）。此外,生殖系统也是黄病毒感染的主要靶器官,例如,JEV感染可导致公猪睾丸炎,ZIKV感染可导致男性睾丸炎并影响精液质量。雄性生殖系统不仅与动物的生殖繁衍相关,也与激素分泌和机体免疫调控密切相关。但JEV、ZIKV等黄病毒感染导致雄性生殖系统损伤的分子机制,黄病毒感染导致的睾丸炎对机体激素分泌和免疫调控的影响等科学问题仍知之甚少。因此,本研究以JEV以及ZIKV为对象,通过建立病毒感染的动物模型和细胞模型,解析JEV和ZIKV感染造成睾丸损伤的机制,评价睾丸损伤后睾酮的分泌情况以及对全身造成的影响,并探究补充睾酮对病毒感染的治疗和免疫调控作用,主要研究内容如下:1.病毒感染诱导睾丸炎的体内模型建立利用JEV P3毒株感染JEV抗体和抗原均为阴性的成年公猪,感染后7天取公猪睾丸组织进行病理学检测。HE染色结果表明,公猪感染JEV后,睾丸组织呈现淋巴细胞浸润以及出血,生精小管排列紊乱等病理变化,生精小管中有大量的生精细胞脱落;进一步的免疫组织化学检测结果表明:JEV入侵睾丸组织后,主要感染睾丸支持细胞、生精细胞;荧光定量检测结果表明,JEV感染公猪睾丸后,可以导致IL-1β、IL-6、IL-8、RANTES、TNF-α等炎症因子的上调表达;通过ELISA试剂盒检测发现公猪感染JEV可导致体内的睾酮分泌水平显著降低。为建立ZIKV感染诱导睾丸炎的模型,本研究使用ZIKV H/PF/2013毒株感染8周龄A129雄性小鼠,感染后第8天小鼠出现精神萎靡,跛行等神经症状,对小鼠进行剖检。ZIKV感染小鼠后,小鼠的雄性生殖系统出现明显的充血现象,睾丸充血萎缩;HE染色结果表明,小鼠感染ZIKV后睾丸生精小管失去原有的结构,生精小管排列紊乱,生精细胞在生精小管中部大量脱落;荧光定量检测结果表明ZIKV感染A129小鼠可导致睾丸内的炎性因子如RANTES、TNF-α、IL-6等显著上调;ELISA检测发现,ZIKV感染后小鼠体内的睾酮水平显著降低。上述结果说明,本研究成功建立了JEV感染诱导公猪睾丸炎和ZIKV感染诱导小鼠睾丸炎的体内模型。2.JEV引发睾丸炎的信号通路研究为了进一步解析黄病毒诱导睾丸炎的分子机制和信号通路,我们以JEV感染ST细胞（猪睾丸细胞系）为模型进行研究。使用1 MOI JEV感染ST细胞24 h后观察发现细胞出现明显病变,Western-blot和间接免疫荧光均可检测到病毒蛋白,说明JEV成功感染ST细胞。荧光定量结果表明炎性因子如IL-1β、IL-6、IL-8、RANTES、TNF-α等均显著上调。利用荧光定量检测模式识别受体的表达,结果表明,RIG-I在JEV感染后表达量显著上调。在此基础上,利用CRISPR/Cas9方法敲低ST细胞中的RIG-I,结果发现RIG-I的敲低可以显著降低JEV感染引发的炎性因子表达,说明RIG-I在JEV感染导致睾丸炎中发挥了重要的作用。进一步研究发现,p65在JEV感染后发生磷酸化并在细胞核内富集,使用抑制剂QNZ抑制p65的激活则可以显著抑制JEV感染导致的炎性因子表达,说明p65也参与了JEV感染诱导的睾丸炎症反应。此外,WB结果表明敲低RIG-I可降低p65的磷酸化,说明RIG-I可以调控p65的激活。上述研究表明,JEV在猪睾丸细胞中通过上调模式识别受体RIG-I,磷酸化激活了p65,使其进入细胞核发挥转录功能,并导致了炎性因子的转录水平增加,产生炎症反应。3.ZIKV感染对小鼠睾酮分泌的影响及睾酮补充对ZIKV致病力的影响如上所述,JEV和ZIKV感染均能导致睾酮的分泌显著降低,而睾酮作为重要的雄性激素对机体免疫又具有调控作用。于是,我们猜测如果在病毒感染的情况下,通过人工补充睾酮是否会对黄病毒感染具有治疗作用呢?为验证这一假设我们以ZIKV感染A129小鼠为模型进行研究。使用ZIKV H/PF/2013株10~3pfu/ml腹腔注射100μl至8周龄A129小鼠,感染后第2、4天,睾酮处理组小鼠腹腔注射睾酮,剂量为0.05 mg/只。实验结果表明睾酮的补充显著提高了小鼠的存活率。为了研究睾酮保护小鼠的具体机制,我们使用相同的方法感染ZIKV并注射睾酮,在感染后第8天收取鼠脑和脾脏样品用于制作病理切片以及流式试验。病理切片结果显示,睾酮的补充减少了脑内的免疫细胞浸润以及病变。通过流式细胞的方法检测脾脏以及脑内的T细胞数量,我们发现睾酮导致CD8+T细胞的数量减少。荧光定量的结果也表明睾酮可以减少脑内的免疫反应。以上结果说明了睾酮通过抑制中枢神经系统内的免疫反应保护了ZIKV感染的小鼠,并且有治疗ZIKV感染的潜力。综上所述,本研究建立了JEV和ZIKV诱导睾丸炎的动物模型,初步阐明了JEV感染导致猪睾丸细胞发生炎症反应的机制,并揭示了睾酮对ZIKV感染的治疗作用,为后续黄病毒感染的预防以及治疗提供了新思路。