论文部分内容阅读
骨再生是一个复杂且精细的生理过程,不仅存在于骨折愈合过程中,而且生理性骨重塑伴随着一生。创伤、感染、肿瘤切除及骨发育异常往往引起大块骨缺损,而大块骨缺损的修复是目前临床治疗中的难题之一。目前,临床治疗有多种方法,包括自体骨移植、同种异体骨移植、组织工程化人工骨和牵张成骨。自体骨移植来源有限并且会造成供区损伤,骨移植替代物的生物力学又难以与正常骨组织吻合。为克服这些方法的局限性,国际上将研究集中于组织工程方面的―局部修复‖策略,同时―系统性‖增强骨修复能力,以达到再生出正常骨组织的目的。基因治疗是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用。第二章中,我们采用共价交联法制备了壳聚糖-低分子量聚乙烯亚胺共聚物(CS-PEI),然后与编码骨形态发生蛋白2(BMP-2)质粒DNA复合制备CS-PEI/h BMP-2纳米粒子,通过MTT、细胞周期及细胞凋亡实验对其生物学相容性进行了检测,结果表明,当CS-PEI的浓度达到100μg/ml时,对小鼠前成骨细胞(MC3T3-E1)的增殖、细胞周期和凋亡无明显影响,具有良好的细胞相容性;凝胶电泳实验结果显示,CS-PEI和DNA的质量比为2:1时,CS-PEI即可完全包封DNA;通过动态光散射测得CS-PEI和DNA的质量达到5:1时,纳米粒子的粒度和电势即达到相对稳定状态,分别为193.4±19.7 nm和24.2±3.3 m V。利用CS-PEI/EGFP转染人胚肾细胞293T和MC3T3-E1,通过荧光显微镜及流式细胞仪检测结果可知,CS-PEI/EGFP可以有效转染人胚肾细胞(293T)和MC3T3-E1细胞,在两种细胞中的的转染效率分别为51.43%和13.92%;Real time-PCR结果可知,CS-PEI/h BMP-2转染MC3T3-E1细胞后可以促进成骨相关基因的表达,茜素红染色及定量结果表明,CS-PEI/h BMP-2可以增加MC3T3-E1细胞钙结节的形成量,Western Blot检测结果表明,CS-PEI/h BMP-2可以激活BMP-2下游信号分子磷酸化Smad 1/5/8的表达,由此,我们可以证明CS-PEI/h BMP-2具有体外促进成骨分化的作用。另外,我们建立了大鼠颅骨临界骨缺损模型,将CS-PEI/h BMP-2复合到明胶海绵支架上,植入到骨缺损处,12周后,通过Micro CT及组织学染色观察骨缺损修复情况,结果表明,CS-PEI/h BMP-2可以在体内有效地促进骨组织再生,骨缺损修复面积达到60.08±4.14%,并且没有明显的体内毒性。雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)通过阻断不同细胞因子受体的信号传导,以阻断T淋巴细胞及其他细胞由G1期至S期的进程,同时阻断T淋巴细胞和B淋巴细胞钙依赖性和非钙依赖性信号传导通路,通过抑制宿主的免疫反应改善成骨微环境;雷帕霉素还是一种有效的自噬诱导剂,通过诱导自噬从而减轻炎症反应;它还能显著刺激BMP/SMAD信号,上调成骨早期标记物RUNX2的表达。在第三章中,我们在CS-PEI/h BMP-2治疗体系中引入了雷帕霉素,通过Real time-PCR结果可知,CS-PEI/h BMP-2+RA组成骨相关基因的表达较其他组(CS-PEI/h BMP-2、RAPA和空白对照)在各时间点均有不同程度的升高,茜素红染色及定量结果表明,CS-PEI/h BMP-2+RA组可以增加MC3T3-E1细胞钙结节的形成数量,由此表明,CS-PEI/h BMP-2+RA组比CS-PEI/h BMP-2组及RA组具有更好的体外促进成骨分化的作用;另外,在大鼠颅骨临界骨缺损模型中,将CS-PEI/h BMP-2+RA复合到明胶海绵支架上,植入到骨缺损处,12周后,通过Micro CT观察骨缺损处修复情况,结果CS-PEI/h BMP-2+RA组的骨缺损处有明显的大块骨片形成,几乎覆盖整个缺损,骨缺损修复面积达到90%以上由此,我们可知CS-PEI/h BMP-2+RA与单独应用基因和药物相比,体内促进骨组织再生的作用更强。EPO(hemopoietin,EPO)具有促进骨再生和血管生成的作用,为便于不规则骨缺损腔隙的修复,在第四章中,我们以壳聚糖、明胶(GA)和β-甘油磷酸钠(GP)为原料,利用离子交联的方法制备了壳聚糖温敏性水凝胶(CS/GP/GA),其具有在室温下(20℃)为液态,在体内温度(37℃)下转变为固态的特性,利用该凝胶缓释EPO,采用ELISA方法检测CS/GP/GA释放EPO的速率,结果表明,2h内,EPO的突释率达到40%,96h释放达到78%,15d内累计释放率达到94%;MTT检测各时间点CS/GP/GA释放的EPO对BMSCs细胞增殖的影响,结果表明,共培养24小时后,EPO-CS/GP/GA组BMSCs细胞增殖率较空白对照组明显增加,增殖率达到120%,相似于未经任何处理的EPO;利用Real time-PCR检测CS/GP/GA释放的EPO对BMSCs细胞成骨分化的影响,结果表明,CS/GP/GA释放的EPO在3d、7d和14d三个时间点均可促进成骨相关因子的表达;此外,我们建立了新西兰兔上颌窦提升术模型,将载有200单位EPO的CS/GP/GA凝胶植入兔上颌窦中,12周后,利用CBCT及组织学染色方法观测到,EPO-CS/GP/GA组兔上颌窦内新骨形成量和成骨细胞数量明显多于单纯载PBS凝胶组。由此证明,EPO-CS/GP/GA可以有效地促进兔上颌窦提升。