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研究背景及目的:增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)是以成纤维细胞的过度增殖和细胞外基质的过度沉积为主要特征的皮肤纤维增生性疾病,其发病机制仍不清楚,目前尚无理想的治疗方法。阐明HS的发病机制,研究针对发病机制的特异性靶点并开发治疗HS的新药有重要临床价值。HS组织中胶原蛋白的沉积显著增多,而胶原蛋白降解的关键酶则是MMP-1,MMP-1的含量多少及活性高低直接影响细胞外基质的降解程度。因此研究MMP-1在HS中的表达和调控对于HS的防治有着重要的意义。MicroRNAs(miRNAs)通过参与转录后基因调控,广泛参与各种皮肤疾病的病理生理过程。目前尚未有miR-222和HS相关的研究报道,本研究的目的是明确miR-222在HS中的表达情况,继而研究miR-222过表达对HS生物学特性的影响,并探讨miR-222参与HS的成纤维细胞增殖调控的相关机制。方法:1、收集36例HS患者的瘢痕组织及邻近正常组织,分离培养成纤维细胞,qRT-PCR 和 Western Blot 检测 Col1A1、Col3A1、MMP1 和 miR-222 的表达。2、采用脂质体法为成纤维细胞分别转染miR-222 mimic、miR-222 inhibitor、scramble control 和 negative control。用 qRT-PCR 检测转染效率,MTT 法检测细胞增殖情况,Western Blot检测PCNA、cyclin D1、cyclin E1和CDK1的表达,流式细胞术检测细胞生长周期和凋亡率。3、生物信息学技术预测miR-222的潜在靶基因。4、采用脂质体法将荧光素酶报告载体MMP1-3’-UTR-Wt或MMP1-3’-UTR-Mut 分别与 miR-222 mimics、miR-222 inhibitor、scramble control 或negative control共转染到HEK 293T细胞中,用双荧光素酶报告基因实验检测荧光值。5、采用qRT-PCR和Western blot检测HS的成纤维细胞转染miR-222 mimic和miR-222 inhibitor及其对照组后MMP1mRNA和MMP1蛋白的表达。6、分别将 miR-222mimic+MMPl,miR-222mimic 和 scramble control 转染HS是成纤维细胞,MTT法检测成纤维细胞增殖速率;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western Blot 检测 PCNA、cyclin D1 和 cleaved caspase3 的表达。结果:1、与正常皮肤组织相比,HS组织中miR-222表达显著上调。2、转染miR-222 mimic组的成纤维细胞中miR-222表达上调,成纤维细胞增殖能力显著提高,PCNA、Col1A1、Col3A1mRNA 及其蛋白、cyclin D1、cyclin E1和CDK1表达和成纤维细胞S期的细胞比例均上调,成纤维细胞凋亡率下降,cleaved caspase-3 和 cleaved caspase-9 蛋白表达下调。而转染 miR-222 inhibitor 组各指标均与转染miR-222 mimic组相反。3、靶基因预测发现MMP1是miR-222的潜在靶基因。共转染miR-222mimic和MMP1-3’UTR-Wt后,报告基因的荧光值降低,共转染miR-222 inhibitor和MMP1-3’UTR-Wt后,则显著增高。证实了 MMP1是miR-222的靶基因。4、转染miR-222 mimic组的HS成纤维细胞的MMP1mRNA和MMP1蛋白的表达下调,转染miR-222 inhibitor组的HS成纤维细胞的MMP1mRNA和MMP1蛋白的表达上调。5、转染miR-222mimic+MMP1组与转染miR-222mimic组比较:HS成纤维细胞增殖速度减慢,细胞凋亡率上升,PCNA,cyclin D1表达下调,cleaved caspase3表达上调。结论:miR-222过表达可以促进HS的成纤维细胞增殖,miR-222可能是通过以下途径调控HS的成纤维细胞增殖:1、调控细胞周期,上调HS的成纤维细胞S期细胞的比例;2、降低成纤维细胞的凋亡率;3、提高HS的成纤维细胞的增殖能力,上调增殖相关蛋白PCNA的表达,促进Col1A1、Col3A1的mRNA及蛋白的表达,而实现促进HS的形成。4、miR-222可能是通过绑定其下游靶基因MMP1的3’-UTR负向调控MMP1的表达而发挥其功能。MMP1可逆转miR-222的部分促纤维化作用。本研究为miR-222/MMP1信号通路可能成为HS诊断和治疗的生物标记物和新的靶点提供了数据支持。