论文部分内容阅读
研究背景粘膜是包括人类免疫缺陷病毒在内的绝大多数病原体入侵机体的主要门户。粘膜固有免疫系统是阻止粘膜感染的天然屏障,具有广谱抗感染能力。作为肠粘膜屏障的重要组成成分,肠道上皮的紧密连接结构可阻止病原微生物及其产物从肠腔内渗透进入粘膜组织以及循环系统。肠道的紧密连接结构一旦被破坏,就会引起肠腔内有害物质及病毒组分的渗透,进而引起炎症反应及粘膜系统的紊乱,最终导致肠道乃至全身免疫系统的活化。虽然长期的抗逆转录病毒治疗能够使HIV-1感染者体内病毒载量得以控制,系统免疫活化处于较低水平,但肠道屏障损伤依然存在,这使得AIDS的治疗变得困难。了解HIV-1感染中肠道紧密连接异常的分子机制对HIV/AIDS中肠道屏障损伤的预防及修复具有重要意义。虽然已知肠道粘膜中CLDN1、CLDN3、OCLN和ZO-1等紧密连接蛋白表达、分布及调控在HIV-1和SIV感染中均发生异常,但仍有多种在屏障功能的维持中发挥重要作用的紧密连接蛋白的变化未见报道,HIV/AIDS相关紧密连接异常的分子机制尚不清楚。作为紧密连接的主要胞外调控因子,IL-17A和TNF-α在HIV-1/SIV感染的肠粘膜中均表达异常。IL-17/IL-17R通路在维持粘膜免疫稳态、肠粘膜屏障完整性以及肠道微生物群的正常组成和功能中发挥至关重要的作用,虽然SIV感染中肠粘膜IL-17A的表达与多种紧密连接基因存在相关性,但IL-17家族其它因子在HIV/AIDS中的变化仍未见报道。HIV-1/SIV感染中肠道Th17细胞的大量损耗、相关炎症过程的激活、微生物移位的产生及病毒组分的存在均有可能是导致肠道粘膜屏障功能异常的重要因素,但IL-17、TNF-α等炎症因子、微生物移位以及这些因素的联合作用对肠道屏障功能的影响仍知之甚少。为此,本文系统地观察了 SHIV/SIV感染的恒河猴(HIV-1感染动物模型)肠道中多种紧密连接相关基因表达的变化及其与IL-17家族细胞因子表达的相关性;建立体外肠道上皮细胞屏障模型研究了 IL-17A和IL-17F对HIV-1 gp140介导的肠道上皮屏障损伤的影响;并探讨了在炎症因子TNF-α和微生物移位的标志物LPS存在时,IL-17A/IL-17F对上皮细胞屏障功能及紧密连接相关蛋白表达的影响。研究方法1.建立实时荧光定量RT-PCR方法检测正常和SHIV/SIV感染的恒河猴(HIV-1感染动物模型)肠道中CLDN2,4,5,7,8,11,12,14,15等多种紧密连接相关基因的mRNA水平以及IL-174/IL-17F及其受体的mRNA水平,利用统计学方法分析紧密连接相关基因与IL-17A/IL-17F/IL-17RmRNA水平之间的相关性。2.利用Transwell嵌入式培养皿构建体外上皮细胞屏障模型(Caco-2细胞),利用测量屏障单层跨膜电阻值和FITC-Dextran透过率的方法评价HIV-1 gp140存在时Caco-2细胞的屏障功能,并利用实时荧光定量RT-PCR方法检测HIV-1 gp140存在时紧密连接相关基因mRNA水平。3.通过实时荧光定量RT-PCR和Western blot的方法检测IL-17A、IL-17F及HIV-1 gp140单独或联合作用下紧密连接相关基因的表达;通过Western blot的方法检测IL-17A和IL-17F作用下NF-κB p65和MAPK p68总蛋白及磷酸化蛋白的表达,利用Act1特异siRNA干扰及BAY11-7082(NF-κB选择性抑制剂)、U0126(MAPK选择性抑制剂)确定参与IL-17A和IL-17F调控紧密连接相关基因表达的信号通路。4.通过实时荧光定量RT-PCR方法检测正常和SHIV/SIV感染恒河猴肠道中TNF-α mRNA水平及肠系膜淋巴结中16SrRNA基因的水平,分析TNF-α与病毒载量及IL-I7RmRNA水平之间的相关性;利用实时荧光定量RT-PCR和Western blot的方法检测在LPS+TNF-α、IL-17A/IL-17F单独及联合作用下IL-17R和紧密连接相关基因及蛋白的表达水平,并利用细胞免疫荧光的方法检测LPS+TNF-α和IL-17A联合作用下紧密连接蛋白ZO-1的表达水平。研究结果1.SHIV/SIV感染的恒河猴肠道粘膜中紧密连接相关基因CLDN5,8,11,12,14 mRNA水平显著低于正常动物。感染动物肠道粘膜中CLDN5和CLDN8 mRNA水平是正常动物中的1/2,CLLN11,12,14 mRNA水平是正常动物中的2/5。CLDN4,7,15 mRNA在正常和感染动物肠道中没有明显差异。在感染动物中CLDN5,8,11,12,14 mRNA水平两两之间存在显著正相关性。2.SHIV/SIV感染动物肠道粘膜中IL-17A mRNA是正常动物中的1/163倍,且感染动物中IL-17A分别与CLDN5、CLDN11 mRNA均存在正相关;感染动物肠道中IL-IL17FmRNA是正常动物中的2.7倍;IL-17RA/IL-17RC mRNA是正常动物中的5～6倍。感染动物中IL-117F与CLDN5,8,11,12,14 mRNA水平均存在负相关性;IL-17RA分别与CLDN3,5,8,12,14mRNA水平呈正相关性;IL-17RC分别与CLDN1,2,3,4,7,15mRNA水平呈正相关性。3.HIV-1 gp140处理24h后Caco-2跨膜电阻值降低了30～40%,FITC-Dextran的透过率增加了约50%,并伴随着CLDN2,2 3,4,5,7,8,OCLN和ZO-1等紧密连接相关基因下调表达了2～3.5倍。IL-17A和IL-17F通过协同上调CLDN1、OCLN和ZO-1等紧密连接蛋白的表达阻止HIV-1 gp140对肠道上皮细胞屏障的损伤。当IL-17A不存在时,IL-17F单独作用对上皮屏障功能有一定的促进作用,但没有统计显著性。siRNA抑制Act1的表达后,IL-17A和IL-17F介导的OCLV和ZO-1转录和蛋白水平均较siRNA control组发生显著下调。IL-17A和IL-17F对紧密连接相关基因的调控伴随着IL-17R下游信号通路NF-κB和MAPK的活化,NF-κB选择性抑制剂BAY11-7082对CLDN1,OCLN和ZO-1的表达均有抑制作用,而MAPK激酶MEK1/2抑制剂U0126仅对ZO-1的表达具有明显的抑制作用。4.SHIV/SIV感染的恒河猴肠道中发生微生物移位,感染动物肠道中TTNF-αmRNA水平是正常动物的2倍,且感染动物中TNF-α分别与病毒载量、IL-117RA、IL-117RC mRNA水平存在正相关性。在体外细胞模型中,LPS+TNF-α与IL-17A/IL-17F联合促进Caco-2细胞中IL-17RA和IL-17RC的表达。HIV-1 gp140单独作用能够抑制IL-17R的表达,但LPS+TNF-α、IL-17A/IL-17F存在时,HIV-1 gp140与LPS+TNF-α、IL-17A/IL-17F的联合作用依然能显著上调IL-17RA和IL-17RC的表达。5.LPS+TNF-α能够轻微上调Caco-2细胞中CLDN1,2,3,4 7,11及ZO-1 mRNA的表达,但不影响CLDN12,14,15和OCLN mRNA的表达。此外,LPS+TNF-α对CLDN5、CLDN8 mRNA表达具有一定的抑制作用。在IL-17A存在时,LPS+TNF-α对肠道上皮细胞屏障功能及紧密连接蛋白CLDN1、CLDN3和ZO-1表达的促进作用大于单独作用之和。在IL-17F存在的情况下,LPS+TNF-α不能够显著促进肠道上皮细胞屏障功能。LPS、TNF-α及IL-17A协同促进紧密连接相关蛋白表达的过程伴随着IL-17R下游信号通路NF-κB和MAPK的活化。NF-κB选择性抑制剂BAY 11-7082对CLDN1、CLDN3和ZO-1表达均有明显的抑制作用;MAPK激酶MEK1/2抑制剂U0126对CLDN3和ZO-1的表达有明显的抑制作用,但对CLDN1表达无明显影响。结论在SHIV/SIV感染的恒河猴肠道中,CLDN5,8,11,12,14等多种紧密连接相关基因均发生了显著下调,HIV-1 gP140能够直接破坏肠道上皮细胞屏障的完整性,病毒及其蛋白组分的存在可能是导致肠道屏障功能破坏的直接原因。LPS+TNF-α与IL-17A在对肠道上皮屏障功能及紧密连接蛋白表达的促进中具有协同作用。虽然HIV/AIDS感染伴随着肠道微生物移位的发生(LPS的存在)和IL-117F、TNF-α等细胞因子的上调表达,但这些因素仅对肠道屏障功能的保护产生微弱的促进作用,肠粘膜中Th17细胞的缺失及IL-17A水平降低可能是造成屏障功能损伤及不易恢复的重要原因。这些结果扩展了对HIV/AIDS中肠道屏障损伤机制的认识,提示针对Th17细胞缺失的额外治疗方法修复肠道屏障功能的可能性。