论文部分内容阅读
目的:研究在造血发育过程中不同阶段不同部位,c-kit~+造血祖细胞中Wnt和Notch信号通路中各成分的时空表达变化。方法:用免疫磁珠阳性分离法分离小鼠孕10.5天(E10.5)、E11.5 AGM区,E12.5、E14.5、E16.5、E18胎肝(Fetal liver, FL)和成体骨髓(Bone marrow, BM)来源的c-kit阳性造血祖细胞,流式细胞术检测其分选纯度。实时定量PCR检测以上时间点和部位分选的造血祖细胞中Wnt信号通路成员(wnt3a, wnt5a, wnt10b, Frizzled3, Frizzled4, Frizzled7, c-myc, ccnb1)和Notch信号通路成员(notch1, notch2, notch3, notch4, jagged1, hes1)的基因表达变化,免疫荧光染色法分别鉴定E10.5 AGM区,E14.5 FL以及BM来源的c-kit~+细胞中WNT3a和NOTCH1蛋白的表达。将E10.5 AGM区,E14.5 FL以及BM来源的c-kit~+细胞体外培养7天,检测其增殖、分化以及集落形成能力。结果:免疫磁珠阳性选择法分选的c-kit~+细胞,纯度可达90%以上。Wnt和Notch信号通路基因在各发育阶段的c-kit~+造血祖细胞均有表达。其中,Wnt和Notch信号通路成员基因在AGM区来源的c-kit~+造血祖细胞中均高表达;胎肝来源c-kit~+造血祖细胞中Notch通路基因表达水平较低,明显低于AGM区和骨髓来源c-kit~+造血祖细胞的表达;而骨髓来源的c-kit~+造血祖细胞中Wnt通路基因表达水平较低,明显低于AGM区和FL来源c-kit~+造血祖细胞的表达(P< 0.05)。免疫荧光染色显示,在AGM区,FL和BM来源的c-kit~+细胞中,WNT3a和NOTCH1蛋白均有不同程度的表达。E10.5 AGM区内WNT3a和NOTCH1蛋白表达最高。与AGM区以及骨髓相比,FL来源的c-kit~+细胞NOTCH1蛋白的表达较低。与胎肝相比,骨髓来源的细胞WNT3a的表达明显降低而NOTCH1蛋白的表达明显升高(P< 0.05)。体外培养7天后,AGM区和胎肝来源细胞具有较强的增殖能力,胎肝来源细胞易于分化,而骨髓来源细胞易于维持其未分化状态。在体外集落形成能力方面,AGM区来源c-kit~+细胞具有较强的形成混合集落形成单位(CFU-Mix)的能力;而FL、BM来源c-kit~+细胞则能形成更多粒单系集落形成单位(CFU-GM)。结论:造血发育过程中,不同发育阶段的造血祖细胞的Wnt和Notch信号通路的活化程度不同,Wnt信号通路在E10.5 AGM区和E14.5胎肝中高度活化可能调控着造血祖细胞的增殖潜能。Notch信号通路在E10.5 AGM区和骨髓内高度活化可能维持着造血祖细胞的未分化状态。Wnt和Notch信号在造血发育过程中的调节具有时空限制性,它们相互协调精确调控着造血。