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目的:对比观察SAMP8小鼠与SAMR1小鼠正中隆起Nestin、Sox2和BrdU阳性细胞的形态和分布。 方法:SAMP8小鼠16只,清洁级,雌雄不限,体质量26g±2g;SAMR1小鼠8只,清洁级,雌雄不限,体质量31g±3g。将实验动物随机分为两组:①正常组(n SA8=8,n SAMR1=4):不作任何处理;②模型组(n SAMP8=8,n SAMR1=4):腹腔注射BrdU生理盐水溶液,连续三日,每日两次,于每日的同一时间注射,两次注射时间间隔2小时。 1、标本制备 1.1正常动物标本制备 用水合氯醛(0.3ml/100g)将正常组麻醉后,自主动脉灌注4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L,PH7.2)进行前固定,立即取脑,后固定。将组织标本随机分组,一组(n SAMP8=4,n SAMR1=2)经脱水,透明,包埋,选取含正中隆起部分,石蜡切片机冠状面切片,厚度约为5μm,制成石蜡切片。另一组(n SAMP8=4,n SAMR1=2)先后经15%蔗糖溶液和30%蔗糖溶液脱水,选取含正中隆起部分,恒温冰冻切片机冠状面切片,厚度约为10μm,制成冰冻切片。对实验动物的处置符合动物伦理学要求。 1.2 BrdU标记动物模型标本取材 将模型组按照100mg/kg进行腹腔注射BrdU生理盐水溶液,连续三日,每日两次,于每日的同一时间注射,两次注射时间间隔2小时。第四日用水合氯醛(0.3ml/100g)将模型组麻醉后,自主动脉灌注4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L,PH7.2)进行前固定,立即取脑,后固定。将组织标本随机分组,一组(n SAMP8=4,n SAMR1=2)经脱水,透明,包埋,选取含正中隆起部分,石蜡切片机冠状面切片,厚度约为5μm,制成石蜡切片。另一组(n SAMP8=4,n SAMR1=2)先后经15%蔗糖溶液和30%蔗糖溶液脱水,选取含正中隆起部分,恒温冰冻切片机冠状面切片,厚度约为10μm,制成冰冻切片。对实验动物的处置符合动物伦理学要求。 2、染色 2.1免疫组织化学染色 将上述石蜡切片分别经Nestin、Sox2和BrdU免疫组织化学染色,使用中性树胶封片后Olympus BX-UCB观察照相。 2.2免疫荧光双标染色 将上述冰冻切片分别经Nestin+Sox2和BrdU+Sox2免疫荧光双标染色后,使用抗荧光衰减封片剂封固后Olympus BX-UCB观察照相。 3、统计学处理 实验结果中所示阳性细胞采用专业图像分析软件Image-Pro Plus6.0测定阳性细胞数,计算阳性率。 结果: 1免疫组织化学结果观察 1.1 Nestin Nestin免疫阳性细胞在ME处明显表达,在ME室管膜带、内带呈强阳性分布,基突伸向外带的血管壁周围。SAMP8(阳性细胞表达率:45.01±3.46%)较SAMR1(阳性细胞表达率:29.81±4.55%)阳性细胞总数量多;SAMP8内带靠近外带的一侧阳性细胞数量较靠近室管膜带的一侧多;SAMR1内带靠近外带的一侧阳性细胞数量较靠近室管膜带的一侧少。 1.2 Sox2 Sox2免疫阳性细胞在ME室管膜带单层整齐分布,中央部少,两侧部略多,染色较第三脑室室管膜Sox2免疫阳性细胞浅。Sox2免疫阳性细胞在ME内带少量分布。SAMR1(阳性细胞表达率:46.40±2.98%)较SAMP8(阳性细胞表达率:24.75±3.12%)阳性细胞总数量多,且在SAMP8内带靠近外带的一侧几乎未见阳性细胞分布,SAMR1可见阳性细胞分布。ME外带细胞稀疏,腹侧可见多个较大的血管。 1.3 BrdU BrdU阳性细胞在ME内带零星分布,SAMP8(阳性细胞表达率:4.31±0.27%)较SAMR1(阳性细胞表达率:2.16±0.10%)阳性细胞总数量略多,SAMP8阳性细胞主要分布于内带靠近外带的一侧,SAMR1阳性细胞主要分布于内带靠近室管膜带的一侧,胞核较大,核内染色不均匀,偶见成对的分裂期的阳性细胞。 2免疫荧光结果的观察 2.1 Nestin、Sox2免疫荧光双标 在ME的内带可见少量Nestin、Sox2免疫荧光双标阳性细胞表达。 2.2 BrdU、Sox2免疫荧光双标 在ME的内带可见少量BrdU、Sox2免疫荧光双标阳性细胞表达。 结论: 1、Nestin免疫阳性细胞于ME的室管膜带、内带密集分布,其突起较长,由背侧向腹侧走行,基突伸向外带血管旁。SAMP8较SAMR1阳性细胞数量多,内带靠近外带侧比内带靠近室管膜带侧表达强。 2、Sox2免疫阳性细胞在ME室管膜带密集分布,内带稀疏分布;SAMP8较SAMR1阳性细胞数量少,内带靠近室管膜带侧比内带靠近外带侧带侧表达强。 3、BrdU免疫阳性细胞在ME内带零星分布;SAMP8较SAMR1阳性细胞数量略多,内带靠近外带侧表达略强。 4、Nestin、Sox2免疫荧光双标细胞和BrdU、Sox2免疫荧光双标细胞多分布于ME的内带。