论文部分内容阅读
目的本研究通过建立高胆红素血症小鼠模型,观察大脑神经细胞全基因组甲基化修饰及其相关甲基化转移酶基因表达水平的变化,初步探讨高胆红素血症致大脑神经损伤中全基因组甲基化修饰所起的作用,为高胆红素血症致大脑神经损伤提供新的防治策略与方法。方法将48只7日龄新生129S小鼠随机分为对照组(生理盐水)、低剂量组(25 mg/kg)、中剂量组(50 mg/kg)和高剂量组(100 mg/kg),每组12只。采用腹腔注射的方法,按照分组剂量注射盐酸苯肼(Phenylhydrazine hydrochloride)溶液进行染毒,染毒24 h后处死小鼠,收集小鼠血液和大脑组织。1.制备脑组织HE染色切片,显微镜下观察脑组织细胞病理学改变;2.分光光度法和酶标仪检测血液样本和脑组织中总胆红素水平、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力;采用ELISA法检测炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosisfactor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、神经特异性烯醇化酶NSE(Neuron Specific Enolase)和S-100钙结合蛋白β(S-100β)的浓度;3.采用实时荧光定量法(RT-qPCR)检测脑组织神经元中Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b基因mRNA表达水平;4.采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测脑组织DNA甲基转移酶蛋白Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b的蛋白表达水平;5.采用免疫荧光法检测神经元全基因组DNA甲基化修饰水平。结果1.应用盐酸苯肼溶液成功建立溶血性高胆红素血症模型,评价指标有:(1)病理切片:对照组中小鼠大脑锥体细胞结构正常,海马CA1区细胞层数排列整齐,低、中、高三个剂量组小鼠脑组织皮层区:锥体细胞核淡染,结构缺失,海马CA1区细胞层数减少,排列散乱,高剂量组尤为突出;(2)氧化应激因子:与对照组相比,高剂量组脑组织中SOD活性、CAT活性、GSH-Px活性均显著性降低(P<0.05),与对照组相比,高剂量组脑组织中MDA含量增加(P<0.05);(3)炎性因子及神经损伤标志物:与对照组相比,高剂量组脑组织IL-1β、TNF-α、NSE和S-100β浓度显著升高(P<0.05);(5)脑和血浆总胆红素(Total bilirubin,TBIL)都呈升高趋势,与对照组相比,高剂量组组血、脑TBIL显著升高(P<0.05)。2.全基因组DNA甲基化修饰水平和相关DNA甲基转移酶的变化:(1)与对照组相比,低、中、高剂量组的大脑组织全基因组DNA甲基化水平均呈不同程度升高;其中高剂量组的DNA甲基化水平最高(P<0.05)。(2)与对照组相比,低、中、高剂量组Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b基因水平呈不同程度的升高趋势。其中,Dnmt3b在中、高剂量组表达显著(P<0.05),Dnmt1、Dnmt3a在高剂量组表达显著(P<0.05);Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b的蛋白表达水平在不同剂量组中均升高,其中Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b在高剂量组显著升高(P<0.05)。结论1.通过腹腔注射一定浓度盐酸苯肼溶液能够成功建立高胆红素血症小鼠模型。主要表现为:小鼠脑组织细胞病理变化、氧化应激、神经元特异性损伤指标改变和炎症反应。2.高胆红素血症小鼠脑组织细胞全基因DNA甲基化修饰水平上升,三种甲基化转移酶(Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b)基因表达水平在mRNA和蛋白质水平明显升高,提示全基因组甲基化修饰水平上升可能在高胆红素血症致神经元损伤机理中扮演着重要角色。